瘦素降低全反式维甲酸诱导的SH-SY5Y细胞tau蛋白过度磷酸化

梁 辰，邓子辉，张金英，郝秀华，薛 辉，颜光涛

解放军总医院 基础所生化室，北京 100853

阿尔茨海默病(alzheimer disease，AD)是一种常见的神经退行性疾病，以进行性认知功能障碍为主要临床症状。临床病理研究发现AD患者的痴呆症状严重程度与脑组织中神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)数量呈正相关，而NFTs的主要成分是过度磷酸化tau蛋白[1]。因此针对tau蛋白可能成为预防和治疗AD的理想途径。瘦素(leptin)是一种主要由脂肪组织分泌的分子量为16 kU的多肽。它由ob基因编码，含有167个氨基酸，而血液中的leptin是去掉N端21个氨基酸残基的信号肽后形成的146个氨基酸的多肽[2]。具有抑制食欲、增加能量消耗、促进脂肪分解、减轻体重等生物学功能。近年的研究发现，瘦素受体(ObR)在脑内广泛表达，分布在下丘脑、海马、小脑和大脑皮质等，瘦素作用于这些脑区可改变神经元或突触的结构、功能及其可塑性，影响神经元存活或增殖，并改善学习、记忆及其他认知功能[3-4]。本研究通过检测AD细胞模型中磷酸化tau蛋白水平的变化情况，探讨leptin与阿尔茨海默病的整体关系，以及leptin对磷酸化tau蛋白的调节作用。

材料和方法

1 材料 人神经纤维母细胞瘤细胞系SH-SY5Y(本实验室保存)；DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(Gibico)；三羟甲基氨基甲烷(Tris)(北京益利精细化学品公司)；Western Blot超敏发光液、RIPA裂解液、Trizol RNA提取试剂、BCA蛋白定量试剂盒(北京普利莱基因技术公司)；一抗：p-tau(ser396)(sc-101815)、tau(TAU-5)(sc-58860)、Actin(sc-1616-R)、Ob-R(sc-8391)(Santa Cruz Biotechnology)；二抗：山羊抗小鼠IgG/辣根酶标记、山羊抗兔IgG/辣根酶标记(北京中杉金桥公司)。Human Ob-Rb：94 ℃ 50 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，40循环，72 ℃ 10 min。Forward：5'-GCCAACAACT GTGGTCTCTC-3'；Reverse：5'-AGAGAAGCACTTG GTGACTG-3'。内参GAPDH 246 bp，95 ℃ 50 s，54 ℃50 s，72 ℃ 1 min，30循环，72 ℃ 7 min。Forward：5'-CCCCTTCATTGACCTCAACTAC-3'；Reverse：5'-G AGTCCTTCCAGGATACCAAAG-3'(北京赛百盛公司)。

2 MTT法检测ATRA浓度梯度对细胞活性的影响将SH-SY5Y消化、收获、计数，各组取5×104/ml细胞100 μl接种到96孔板，每组两列10个平行孔。加入ATRA浓度分别为5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L，培养6 d后，每孔加入四甲基偶氮唑蓝(MTT，浓度为5 mg/ml)100μl，置于37 ℃、5% CO2孵箱中继续孵育4 h，弃上清，加入二甲基亚砜100 μl，震荡5 min，用酶标仪在570 nm处读取吸光度值(A值)，取平均值为细胞增殖水平。

3 ATRA诱导AD模型的建立 培养SH-SY5Y细胞丰度达到60%，倒掉原有培养基，PBS冲洗3遍，加入含有ATRA(40 μmol/L)不含血清的DMEM培养基中，连续诱导6 d建立模型，加入leptin(0.5 μg/ml)作用12 h。

4 细胞形态学观察 将处于对数生长期的细胞以1×106个/孔种于6孔板中，ATRA诱导，分为对照组、模型组，分别于4 h、1 d、2 d、6 d时间点置于倒置显微镜下观察，并拍照。

5 RT-PCR检测Ob-Rb mRNA的表达 用Trizol RNA提取试剂抽提细胞中总RNA，以Ob-Rb引物在反转录酶作用下进行逆转录反应，随后进行33个循环的PCR扩增。同时，PCR扩增管家基因GAPDH作为参照。

6 Western Blot检测p-tau表达水平 用RIPA蛋白裂解液提取总蛋白，BCA法蛋白定量。蛋白上样量为30 μg，在质量分数为10%的PAGE上进行SDS-PAGE垂直电泳，电转移到硝酸纤维素(nitrocellulose，NC)膜上(100 V，1.5 h)。将NC膜放入封口塑料袋中，加入含5%脱脂奶粉(TBS/T溶解，下同)，4 ℃封闭过夜后，将NC膜转入另一封口塑料袋中，分别在不同的膜中加入稀释好的一抗p-tau、Tau-5(各1∶1 000)。37 ℃孵育1 h，TBS/T漂洗NC膜3次，每次10 min。再向膜中加入辣根过氧化物酶标记的IgG抗体(1∶2 000)，37 ℃孵育40 min，TBS/T漂洗NC膜3次，每次10 min。加入发光液，暗室曝光，使用凝胶扫描仪测其灰度值。使用软件计算p-tau灰度值比(p-tau 5/Tau-5)，组间进行统计学分析。

7 统计学方法 采用Stata7.0软件进行统计学分析，数据以-x±s表示，组间比较用t检验， P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 ATRA对细胞增殖活性的影响 MTT法检测SH-SY5Y细胞增殖水平显示，ATRA诱导组在40 μmol/L浓度下A值明显低于对照组(P＜0.01)，5、10、20 μmol/L ATRA诱导组A值差异无统计学意义(P＞0.05)，见图1。

图 1 MTT实验后各组A值(aP＜0.01, vs control)Fig. 1 A value for each group after MTT assay(aP＜0.01, vs control)

2 ATRA对SH-SY5Y细胞形态的影响 正常SHSY5Y细胞接种4 h时尚未分化，呈略圆形特征，并少见短形突起(图2A)；贴壁生长后1 d展现出更类似于神经元的表型，大小不一，呈不规则形，圆形特征丢失，少见梭形(图2B)；连续加入ATRA处理2 d，开始展现神经元的形态，即轴突开始生长(图2C)；ATRA连续处理6 d，细胞呈现出成熟神经元的形态，轴突伸展并时而与相邻细胞连接(图2D)。

图 2 倒置显微镜下ATRA诱导前后细胞形态(200×)Fig. 2 Cell morphology before and after ATRA induction was observed by inverted microscope(200×)

3 ATRA诱导后ObRb mRNA表达变化 诱导组ObRb mRNA表达显著升高，提示AD模型建立后leptin发挥作用，见图3。

4 Leptin处理后p-tau蛋白表达变化 Western Blot结果显示，与空白对照组相比，ATRA诱导模型后p-tau蛋白表达水平明显增加(P＜0.01)，说明模型建立成功，加入leptin(0.5 μg/ml)作用12 h后，与模型相比有明显降低(P＜0.01)，见图4。

图 3 RT-PCR检测ObRb mRNA表达(P＜0.01)Fig. 3 RT-PCR showing expression of ObRb mRNA(P＜0.01)

图 4 Western Blot检测p-tau蛋白的表达(aP＜0.01, vs control)Fig. 4 Western blot showing expression of p-tau protein(aP＜0.01,vs model)

讨 论

神经纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)是AD的两种最为主要的病理特征之一，主要存在于患者的海马、杏仁核、前额叶等部位[5]。NFTs主要由过度磷酸化的tau蛋白聚集而形成，tau蛋白在亚细胞水平上主要定位于细胞质，大多在中枢神经系统区域神经元的轴突表达[6]。它通过与多种蛋白相互作用来行使其功能，例如tau蛋白可以结合并稳定微管系统，可提高体外培养神经元突触的生长速率和范围。

Tau有着不同的聚集状态，其中可溶性的寡聚体比大分子、不溶性的高度成纤维聚集体更具致病性[7]。Tau蛋白可以被多种蛋白激酶磷酸化，例如：AMP活化的蛋白激酶、应激活化的蛋白激酶、糖原合成酶激酶3、细胞周期依赖性蛋白激酶5、促分裂原活化的蛋白激酶、酪蛋白激酶、钙/钙调蛋白依赖蛋白激酶Ⅱ、微管亲和调控蛋白激酶、蛋白激酶A等[8]。迄今为止，围绕关注于tau蛋白的异常磷酸化以及tau与AD之间的关系的研究逐渐深入，干扰tau蛋白的过度磷酸化被认为是神经退行性疾病治疗的关键[9]。

瘦素主要由白色脂肪组织分泌，通过下丘脑来调节新陈代谢、摄食、能量平衡等生理活动。Vannucci等[10]研究发现db/db小鼠与正常小鼠比较其大脑体积明显缩小，并伴有神经元密度减低和功能下降，提示leptin可能参与神经系统生理活动。

本研究中，检测到细胞瘦素受体(ObRb)mRNA表达升高，提示leptin可能在此损伤中发挥直接的作用；在给予外源性leptin作用后，检测到p-tau蛋白水平也显著降低，提示leptin可能通过降低p-tau蛋白的表达对AD起到改善作用。从而认为leptin可能作为阿尔茨海默病治疗的新靶点，其作用机制值得深入研究。

1 张松江，王建人，邬力祥. 阿尔茨海默病中的β-淀粉样蛋白和Tau蛋白［J］.生命的化学，2012，32（3）：254-258.

2 Malendowicz LK， Rucinski M， Belloni AS， et al. Leptin and the regulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis［J］. Int Rev Cytol， 2007， 263：63-102.

3 Morrison CD. Leptin signaling in brain： A Link between nutrition and cognition?［J］. Biochim Biophys Acta， 2009， 1792（5）： 401-408.

4 Moult PR， Harvey J. Hormonal regulation of hippocampal dendritic morphology and synaptic plasticity［J］. Cell Adh Migr， 2008， 2（4）：269-275.

5 王维治．神经病学［M］.北京：人民卫生出版社，2007：1397-1405．

6 Cleveland DW， Hwo SY， Kirschner MW. Physical and chemical properties of purified tau factor and the role of tau in microtubule assembly［J］. J Mol Biol， 1977， 116（2）： 227-247.

7 Morris M， Maeda S， Vossel K， et al. The many faces of tau［J］.Neuron， 2011， 70（3）： 410-426.

8 王建枝，田青．Tau蛋白过度磷酸化机制及其在阿尔茨海默病神经元变性中的作用［J］.生物化学与生物物理进展，2012，39（8）：771-777．

9 靳慧，张英东，杨霞，等．tau蛋白相关阿尔茨海默病治疗进展［J］.中国老年学杂志，2012，32（6）：1308-1310．

10 Vannucci SJ， Gibbs EM， Simpson IA. Glucose utilization and glucose transporter proteins GLUT-1 and GLUT-3 in brains of diabetic （db/db） mice［J］. Am J Physiol Endocrinol Metab， 1997， 272（2 Pt 1）：E267-E274.