模拟失重致心肌细胞凋亡及其相关机制探讨

王永春，伍 静，张 舒，曹新生，王 冰，石 菲，杨长斌，高 原，杜挺媛，赵疆东，孙喜庆第四军医大学 航空航天医学系航空航天生物动力学教研室，航空航天医学教育部重点实验室，陕西西安7003；第四军医大学 训练部，陕西西安 7003

在航天飞行时，重力的消失将引起人体生理系统明显改变，特别是在中长期失重环境下，可引起机体出现广泛的心血管系统变化，在心脏中可表现出心肌萎缩、心律失常和心肌代谢异常等变化，严重威胁航天员的安全[1]。失重环境导致的心血管功能失调已成为妨碍航天员健康和太空探索能力最重要的难题之一，如何改善心脏功能，维持心血管功能的稳定，已成为防治失重致心血管功能变化的关键所在。心肌细胞凋亡在心血管疾病中广泛存在，心肌细胞凋亡数量和程度的变化对心血管疾病的发生和发展具有直接影响。有关模拟失重环境下心肌细胞凋亡的发生和调控机制尚需进一步阐明。细胞核转录因子GATA结合蛋白4(GATA-4)和心肌细胞增强因子2A(MEF2A)在细胞的生长发育、损伤修复及细胞存活中具有重要的调节作用[2-3]。本研究以大鼠心肌细胞为研究对象，旨在观察回转器模拟失重对大鼠心肌细胞凋亡相关通路基因及蛋白的影响，为深入研究航天飞行中机体心脏凋亡的分子机制提供理论依据。

材料和方法

1 主要试剂与仪器 1~3 d龄新生Sprague Dawley大鼠购自第四军医大学实验动物中心。DMEM高糖培养基(HyClone公司)，胎牛血清(FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司)，RNA提取试剂盒(Promega公司)，RT-PCR试剂盒(Takara公司)，GATA-4和MEF2A一抗分别购自Immunoway公司，c-myc一抗和羊抗兔二抗购自ABcom公司，ECL发光试剂盒(Pierce公司)。二氧化碳培养箱(美国Kendro实验室产品公司)，Nikon TS100倒置显微镜(Nikon公司)，超净工作台(苏州净化)，细胞培养专用2D-RWVs回转器(北京科林恒达科技发展有限公司)，凝胶图像分析系统(北京天能公司)。

2 细胞处理及分组 实验分为96 h回转组和对照组。心肌细胞以含100 ml/L FBS的DMEM高糖培养液常规培养。模拟失重前1 d，将心肌细胞以每片1×105个的细胞密度接种于2.55 cm×2.15 cm的玻片上，置于6孔板中于5% CO2、37 ℃恒温培养箱中培养过夜。将玻片插入回转舱中并灌满培养液，以30 r/min的速度水平回转即可完成心肌细胞模拟失重的模拟。对照组置于5% CO2、37 ℃恒温培养箱中平行培养。细胞分别在回转和1 G重力环境下培养96 h后，进行后续实验。

3 RT-PCR检测 提取各组细胞的总RNA，以紫外分光光度法计算总RNA的浓度，反转录获取cDNA待用。采用25 μl反应体系，其中引物序列为：1)内参GAPDH：上游引物：5'-CGTCTTCACCACCATGGAGA-3'，下游引物：5'-CGGCCATCACGCCAC AGTTT-3'；2)扩增c-myc：上游引物：5'-AACTTACAATCTGCGAGCCA-3'，下游引物：5'-AGCAGCTCGAATTT CTTCCAGATAT-3'。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，以阳性目的条带/GAPDH基因条带光密度的比值作为目的mRNA的相对表达量。

4 Western Blot检测 用RIPA lysis buffer 200μl裂解细胞并提取蛋白，BCA法蛋白定量，取20 μg的细胞蛋白抽提液行SDS-PAGE电泳分离，继而转移至硝酸纤维素膜上，室温封闭3 h，分别加入c-myc抗体(1∶1 000)、GATA-4抗体(1∶500)及MEF2A抗体(1∶1 000) 4 ℃孵育过夜，HRP辣根过氧化酶二抗(1∶5 000)，室温孵育1 h，化学发光法显色。用GAPDH为内参照，以阳性条带与内参照光密度比值作为目的蛋白的相对表达值。

5 统计学处理 所有实验均在相同条件下重复3次。实验数据以-x±s表示，采用SPSS11.5软件进行统计学分析。组间比较结果采用单因素方差分析F检验，统计学差异检验水准为P＜0.05。

结 果

1 细胞凋亡相关基因及蛋白表达的改变 对照组c-myc mRNA及蛋白呈低量表达，而回转模拟失重96 h组大鼠心肌细胞c-myc mRNA及蛋白的表达与对照组相比均显著增加(P＜0.05)，见图1。

图 1 模拟失重对心肌细胞c-myc mRNA和蛋白表达的影响A： mRNA结果； B： 蛋白结果 与对照组比较， aP＜0.05Fig. 1 Effect of simulated microgravity on expression of c-myc mRNA (A) and protein (B)in myocardiocytes

图 2 模拟失重对心肌细胞转录因子GATA-4蛋白表达的影响 与对照组比较， aP＜0.05(左)图 3 模拟失重对心肌细胞转录因子MEF2A蛋白表达的影响 与对照组比较， aP＜0.05(右)Fig. 2 Effect of simulated microgravity on expression of GATA-4 protein in myocardiocytes(left)aP＜0.05, vs control groupFig. 3 Effect of simulated microgravity on expression of MEF2A protein in cardiomyocytes(right)aP＜0.05, vs control group

2 转录因子GATA-4和MEF2A表达的改变 转录因子GATA-4和MEF2A在细胞凋亡的调控中起重要作用，本研究对两者的表达进行了检测。心肌细胞回转模拟失重96 h后，转录因子GATA-4和MEF2A蛋白与对照组相比显著下降(P＜0.05)，提示模拟失重可致转录因子GATA-4和MEF2A蛋白表达降低，见图2、3。

讨 论

既往研究发现，所有航天员在飞行后都会出现不同程度的心血管系统适应不良，主要表现为立位耐力下降与运动耐力降低；轻者立位时出现心率增快、血压骤降、头晕等；重者在立位时立即发生晕厥，严重影响了航天员的健康以及航天任务的完成，成为中长期载人航天的主要限制因素[4]。

航天医学研究结果表明，失重或模拟失重环境可导致心脏出现每搏量减少、收缩功能降低和心肌电活动异常等变化，并观察到失重或模拟失重后，动物出现心肌萎缩、心肌细胞脂滴及糖元增多和线粒体变性等结构改变[5]。提示航天飞行后心脏结构及功能的变化可能在失重后心血管适应不良中起重要作用。有研究发现，模拟失重可致肺组织细胞、胃癌细胞、血管内皮细胞凋亡增加，尾悬吊模拟失重大鼠的心肌细胞凋亡率较对照组增高[6-9]。本研究发现，模拟失重致体外培养的心肌细胞出现凋亡相关调控分子c-myc基因及蛋白的表达均显著增加，进一步证实了模拟失重可增加心肌细胞凋亡。然而，有关失重/模拟失重环境下所致的心肌细胞凋亡的相关分子机制却鲜见报道。有研究显示，PI3K/Akt信号通路在心肌细胞凋亡的发生发展中具有重要作用[10]。本研究结果表明，模拟失重96 h可致心肌细胞的凋亡基因及蛋白表达增加；同时对细胞凋亡有重要调控作用的转录因子GATA-4表达显著降低，而转录因子MEF2A表达显著增加；提示模拟失重96 h所致心肌细胞凋亡显著增加可能存在转录水平的调控机制。

GATA结合蛋白家族广泛存在于动植物和真菌、线虫等体内，是调节细胞生长与分化的重要转录因子。GATA-4是调控心脏基因表达的重要转录因子，参与了心脏正常发育、功能基因表达和心肌肥大的病理过程，还在心肌重塑过程中发挥重要的调控作用[11]。实验证明，过表达GATA-4能使体外培养的大鼠心肌细胞表面积增大，肌小节增生，胞内总蛋白积累显著增多；而过表达GATA-4的成年转基因小鼠可检测到心肌肥厚相关基因如ANF和内皮素等的激活[12]。除了调控细胞的生长以及分化外，GATA-4还在细胞凋亡的调控中起重要作用[13]。研究发现，GATA-4活性的降低可致大鼠心肌细胞出现凋亡，而恢复GATA-4活性水平可减弱凋亡水平。近期也有研究发现，GATA-4通过调节bcl-2的激活而决定细胞是凋亡还是存活[14]。GATA-4对抗凋亡蛋白bcl-2具有重要调节作用，在体外培养的心肌细胞中，过表达GATA-4可提高bcl-2的基础表达，而特异性抑制GATA-4的表达，bcl-2的表达水平则大幅度降低。

MEF2属于转录因子MADS-box家族，由一个MADS结构域和N端MEF2特定结构域组成。脊椎动物的MEF2基因家族共有四个成员：MEF2A，MEF2B，MEF2C，MEF2D，分别定位于不同的染色体上。MEF2A蛋白定位于15q26染色体上，由507个氨基酸组成。MEF2的突出功能是控制肌细胞分化过程中的基因转录，维持心肌细胞构造的完整和保持适当的线粒体容量。MEF2蛋白在细胞的信号转导、增殖以及生存与凋亡中发挥重要作用。研究表明，MEF2的转录活性在维持线粒体功能活性中起重要作用，抑制MEF2的活性可以导致心肌细胞出现线粒体功能降低，活性氧簇超量表达及细胞凋亡的增加[15]。已有研究证实，MEF2家族成员可与GATA-4直接相互作用激活下游基因的表达，GATA4通过其C末端的锌指结构域与MEF2蛋白的DNA结合结构域直接作用，形成GATA4-MEF2复合体[16]。这说明GATA-4和MEF2A之间有一定联系，可能通过协同作用共同参与调节成年心肌细胞的凋亡和存活。本研究结果表明，模拟失重96 h可致心肌细胞转录因子MEF2A基因及蛋白水平表达降低，与GATA-4的表达趋势一致。

总之，本研究发现，回转器模拟失重96 h可引起体外培养的心肌细胞出现凋亡增加，心肌细胞转录因子GATA-4和MEF2A表达降低可能在模拟失重所致的心肌细胞凋亡过程中起重要作用。转录因子如何调控心肌细胞凋亡，对它们的干预是否能防止心肌细胞凋亡，将是我们下一步研究的内容。

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