热灭活和紫外线照射灭活结核分枝杆菌的实验效果分析

赖赛麟 李海成 王威 孙毅凡 郭卉欣 陈涛 江勇 钱明 江振友 周琳 钟球

·短篇 论著·

热灭活和紫外线照射灭活结核分枝杆菌的实验效果分析

赖赛麟 李海成 王威 孙毅凡 郭卉欣 陈涛 江勇 钱明 江振友 周琳 钟球

我国卫生部公布的《人间传染的病原微生物名录》中结核分枝杆菌被列为第二类病原微生物（危害程度为Ⅲ级），属高致病性病原微生物［1］。实验室研究课题中，大部分涉及到结核分枝杆菌的操作，实验室生物安全是首先要解决的问题。至今，已有一些关于实验室工作人员患结核病的报道，其中呼吸道吸入感染是实验室感染的最主要类型［2］。根据传染病发生必须存在的3个条件：传染源、传播途径和易感者。在实验操作中如果做好传染源的控制，如避免产生活菌气溶胶、有效灭活细菌等，实验室生物安全就有了最根本的保障。本实验探讨了实验室结核分枝杆菌传染源控制中的热灭活和紫外线照射灭活方法的效果，为保障生物安全提供参考依据。

材料和方法

一、实验材料

1.实验菌株：6株结核分枝杆菌：BCG：牛结核分枝杆菌；H37Ra：结核分枝杆菌减毒株；H37Rv：结核分枝杆菌标准株；Se：临床分离敏感菌株；MDR：临床分离耐多药菌株；XDR：临床分离广泛耐药菌株。上述菌株均由广东省结核病控制中心提供，均已经过对硝基苯甲酸（PNB）、噻吩-2-羧酸肼（TCH）鉴别培养基进行菌群初筛鉴定为结核分枝杆菌，并经过了基因分型鉴定和药敏鉴定为相应菌株。

2.改良罗氏固体培养基：由广东省结核病控制中心制作提供。

3.比浊仪：法国bioMérieux（生物梅里埃）公司生产的DensiCHEK Plus比浊仪。

4.生物安全柜：新加坡Esco公司生产的Labculture 2级生物安全柜。

5.电热仪：杭州奥盛仪器有限公司生产的干式恒温器。

6.紫外线灯：新加坡Esco Labculture 2级生物安全柜内置30 W紫外线灯，距离工作台面约70 cm，寿命在有效期内，使用前已用75%乙醇纱布擦拭清洁。

7.37 ℃培养箱：上海一恒科技有限公司生产的LRH系列生化培养箱。

二、实验方法

1.制备菌悬液：6株细菌已在改良罗氏培养基培养5周，用接种环分别刮取菌株纯培养物至6个磨菌器中，用巴氏管加入无菌10%吐温-80的水溶液3滴，研磨后加入无菌磷酸盐缓冲液（PBS）稀释，转移至一塑料试管经比浊仪测量，根据读数稀释为100mg/ml，其余两个浓度为10-1mg/ml、10-2mg/ml菌悬液在此基础上依次加PBS稀释制备。

2.加热灭活：实验在Esco Labculture 2级生物安全柜中操作。吸取菌悬液1 ml至有螺纹盖的2 ml离心管（EP管）中，转移至已设好温度的电热仪孔中，加热至不同时间取出，立即将处理后的菌悬液用10μl标准接种环各接种3环到2个改良罗氏固体培养基斜面，设立PBS阴性对照，培养基空白对照和各菌悬液阳性对照，放37℃培养箱培养8周，实验按菌液浓度分批进行。

3.紫外线照射灭活：实验在Esco Labculture 2级生物安全柜中操作，BSL-2负压实验室内的温度为22℃，相对湿度为24%。吸取各菌株的菌悬液各1 ml至6孔培养板，开盖置安全柜内置的紫外线灯下，垂直距离70 cm，照射至不同时间终止照射，将照射后的菌悬液用10μl标准接种环各接种3环到2支改良罗氏固体培养基斜面，设立PBS阴性对照，培养基空白对照和各菌悬液阳性对照，放37℃培养箱培养8周，实验按菌液浓度分批进行。

4.结果观察记录：在经灭活处理后培养的第4周，观察记录培养基斜面的残存菌落生长情况，第8周观察记录阴性结果：（1）无菌落生长记录为“-”。（2）菌落数≤50个记录实际菌落数。（3）菌落数＞50个，生长面积≤1/4记录为“十”；1/4＜生长面积≤1/2记录为“十十”；1/2＜生长面积≤3/4记录为“十十十”；生长面积＞3/4记录为“十十十十”［3］。记录结果为2支罗氏培养基表面生长菌落的平均值。

结 果

一、热灭活

6株菌株3个菌液浓度的阳性对照均有大量菌落生长，PBS阴性对照及罗氏培养基空白对照均没有菌落生长。在加热温度、时间相同的条件下，随着灭活对象菌悬液浓度的增大，细菌的残存数呈增多趋势；在菌液浓度、加热时间相同的情况下，随着加热温度的增大，细菌的残存数呈减少趋势；在菌液浓度、加热温度相同的条件下，随着加热时间的增加，细菌的残存数呈减少趋势。在温度≥80℃，加热时间≥10 min的条件下，6株菌株10-2、10-1、100mg/ml 3个浓度1 ml菌悬液里的细菌可以被有效灭活（表1）。

表1 不同加热时间各菌株10-2、10-1、100mg/ml 3个菌液浓度1 ml菌悬液经不同温度热灭活的结果

二、紫外线照射灭活

6株菌株3个菌液浓度的阳性对照均有大量菌落生长，PBS阴性对照及罗氏培养基空白对照均没有菌落生长。在紫外线照射距离、照射时间相同的条件下，随着菌液浓度的增大，细菌的残存数呈增加的趋势；在紫外线照射距离、菌液浓度相同的条件下，随着照射时间的增加，细菌的残存数呈减少的趋势；在照射距离为70 cm，照射时间≥40 min的条件下，6株菌株10-2、10-1、100mg/ml 3个菌液浓度1 ml菌悬液里的细菌可以被紫外线有效灭活（表2）。

表2 不同菌株10-2、10-1、100mg/ml 3种菌液浓度1 ml菌悬液经紫外线照射的灭活结果

讨 论

首先，本灭活实验研究中同时设立的6株菌株3个菌液浓度的阳性对照均有大量菌落生长，PBS阴性对照及罗氏培养基空白对照均没有菌落生长，保证了实验结果准确地反映灭活处理的效果。

一、关于影响热灭活结核分枝杆菌效果的因素分析

在针对结核分枝杆菌的分子生物学水平的实验操作前，如菌种分子鉴定、基因分型及耐药基因分析等，必须先对培养物或临床样本进行确切灭活。目前的灭活方法主要是热灭活法，但温度和时间各不相同，最常见的方案是80℃，灭菌30 min［3］，但也有文献指出这个简单的80℃灭活方案的重复性依然有争议［4］。本次热灭活实验设计了温度梯度、时间梯度和菌液浓度梯度进行了探讨，从表1的结果数据来看，80℃灭活方案的有效性得到了支持。但是在60℃、70℃灭活方案中，在加热温度、时间相同的条件下，随着灭活对象菌悬液浓度的增大，细菌的残存数呈增多趋势。因此，必须考虑到菌液浓度因素的影响，如果菌液浓度继续增大，甚至远超出本次实验100mg/ml的范围，80℃的灭活方案是否也会出现残存的活菌？这是个值得进一步研究的问题，可能也是80℃灭活方案还具有争议性的问题所在。另一方面，从表1还可以看到：在菌液浓度、加热时间相同的情况下，随着加热温度的增大，细菌的残存数呈减少趋势；在菌液浓度、加热温度相同的条件下，随着加热时间的增加，细菌的残存数呈减少趋势。所以，笔者建议：在不影响后续分子生物学实验的前提下，宜提高灭活温度或者延长灭活时间，以最大程度地降低生物安全风险。

二、关于影响紫外线照射灭活结核分枝杆菌效果的因素分析

本次紫外线照射灭活实验只设计了时间梯度和菌液浓度梯度，解读表2结果数据，灭活效果影响因素跟热灭活实验有相似之处：延长作用时间会增强灭活效果，菌液浓度的增大会减弱灭活效果。紫外线消毒有一个特别需要注意的特点是紫外线的穿透力弱，任何可以阻挡紫外线穿透的东西都会减弱灭活效果，如空气湿度、菌液厚度，等等。因此，生物安全柜每次紫外线消毒前应先用能有效杀灭结核分枝杆菌的75%乙醇擦拭污染的工作台面，双管齐下，以最大程度地灭活污染台面的活菌。另外，根据大量文献报道，用紫外线对物体表面进行消毒时，灯管距物体表面的距离一般不超过1 m，照射时间一般不少于30 min［5］。本次实验在照射距离为0.7 m的条件下，照射时间达到40 min才能检测不出残存的活菌，与文献报道相似。

其实，紫外线对结核分枝杆菌的杀菌效能，周维新［6］早有研究。结核分枝杆菌对紫外线敏感，室内空气和物体表面可直接照射部分，紫外线消毒效果肯定有效［3］。使用紫外线灭菌装置进行物品表面消毒时，灯管距离物体表面不得超过1 m，应使照射表面受到紫外线的直接照射，且应达到足够的照射剂量，使用中灯管的照射强度不得低于70μW/cm2；使用紫外线灭菌装置进行室内空气消毒时，房间内应保持清洁干燥，温度低于20℃或高于40℃，相对湿度大于60%时应适当延长照射时间［7］。消毒效果与距离成反向线性关系［8］。

因为结核分枝杆菌是高致病性、可以经呼吸道传染的病原微生物，对实验人员的健康构成严重威胁。本次紫外灭活实验只能模拟物体表面受菌液污染，局限于用生物安全柜内置的紫外线灯进行。灯管离工作台面垂直照射距离约70 cm，故不能设计更长的照射距离，亦不能设计气溶胶灭活实验，这是本次实验的局限。

［1］刘国传，刘来福，张利峰，等.检验检疫病原微生物实验室的生物安全.检验检疫学刊，2009，19（3）：50-52.

［2］陆兵，刘秋焕，王荣，等.结核分枝杆菌实验室获得性感染事件分析.中国防痨杂志，2012，34（5）：333-335.

［3］陈明亭，万康林.结核病实验室技术手册.北京：科学出版社，2011.

［4］Zwadyk P Jr，Down JA，Myers N，et al.Rendering of mycobacteria safe for molecular diagnostic studies and development of a lysis method for strand displacement amplification and PCR.J Clin Microbiol，1994，32（9）：2140-2146.

［5］谢立新，金玉怀，张永红，等.影响紫外线杀菌的因素分析.华北煤炭医学院学报，2005，7（3）：372-373.

［6］阎邦首.紫外线对结核菌的杀菌效能.中国防痨杂志，1964，5 （2）：409-411.

［7］王黎霞，成诗明，何广学，等.中国结核感染控制标准操作程序.北京：人民卫生出版社，2012.

［8］周维新.紫外线辐射强度与电压和距离的关系.中国消毒学杂志，1991，10（4）：237-238.

（本文编辑：薛爱华）

国家“十二五”科技重大专项（2012ZX10004903；2013ZX10003001）

510630广州，暨南大学医学院微生物与免疫教研室（赖赛麟、孙毅凡、江振友）；广东省结核病控制中心 广东省“十二五”结核病防治转化医学重点实验室（李海成、郭卉欣、陈涛、江勇、钱明、周琳、钟球）；广东省佛山市第四人民医院检验科（王威）

钟球，Email：zhongqiu@vip.163.com

2013-06-06）