VDR-TaqⅠ、FokⅠ位点多态性与宁夏人群结核易感性研究

陈丹丹 朱圭娜 关光玉 Magda Ellis Donald P.Mc Manus 杨玉荣

·论 著 ·

VDR-TaqⅠ、FokⅠ位点多态性与宁夏人群结核易感性研究

陈丹丹 朱圭娜 关光玉 Magda Ellis Donald P.Mc Manus 杨玉荣

目的 探讨维生素D受体（VDR）基因TaqⅠ、FokⅠ位点基因多态性与宁夏回族自治区人群肺结核易患性之间的关系。方法 搜集宁夏南部8个地区2010年7—11月确诊的肺结核患者993例（简称“病例组”），其中男550例，女443例；同期选择来源地区，与病例组性别相同、民族相同、年龄相当、居住环境相匹配的确认无肺结核的健康人880名（简称“对照组”），其中男485名，女395名。将聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCRRFLP）检测VDR基因多态性的方法，应用于人群结核病易感性的病例-对照研究。用SPSS 16.0软件对检测结果进行数据统计，各基因型与结核易感性关系用单因素分析和多因素logistic回归分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。结果VDR-TT、Tt、tt基因型在病例组和对照组中分布频率分别为83.0%（815/982）、15.2%（149/982）、1.8%（18/982）和84.7%（739/872）、14.7%（128/872）、0.6%（5/872），病例组与对照组差异有统计学意义（χ2= 6.15，P=0.046）。VDR-FF、Ff、ff基因型病例组和对照组分布频率分别为32.4%（316/976）、47.9%（468/976）、19.7%（192/976）和28.5%（245/861）、53.3%（459/861）、18.2%（157/861），病例组和对照组分布差异无统计学意义（χ2=5.41，P=0.067）。在显性基因模型中，VDR-（TT十Tt）、tt基因型病例组和对照组中分布频率分别为98.2%（964/982）、1.8%（18/982）和99.4%（867/872）、0.6%（5/872），病例组和对照组中分布差异有统计学意义（χ2=5.98，P=0.014；OR=0.98、3.19，95%CI=0.978～0.997、1.193～8.574）；在纯合基因模型中VDR-（FF十ff）、Ff基因型在病例组和对照组中频率分别为52.0%（508/976）、48.0%（468/976）和46.7%（402/861）、53.3% （459/861），病例组和对照组分布差异有统计学意义（χ2=5.27，P=0.022；OR=1.12、0.89，95%CI=1.023～1.298、0.822～0.985）。结论 在宁夏人群中，肺结核易患性可能与VDR-TaqⅠ、FokⅠ位点多态性有关联，VDR-（FF十ff）、tt基因型可能是罹患肺结核的危险因素，而VDR-（TT十Tt）、Ff基因型可能是保护因素。

结核，肺/遗传学； 受体，骨化三醇； 多态性，单核苷酸； 疾病遗传易感性； 病例对照研究；宁夏［回族自治区］

维生素D（Vit D）的经典生物学功能是调节机体钙磷代谢。但是，近年来研究发现，Vit D在体液免疫和细胞免疫方面具有重要的调节功能［1-2］，与机体抗结核分枝杆菌的免疫保护机制有关。Vit D的活性代谢产物是1，25-二羟维生素D3，该产物生物学功能的发挥由Vit D受体（VDR）蛋白介导。人类VDR基因位于第12染色体长臂，其中，rs731236、rs2228570位点分别对应限制性内切酶TaqⅠ、FokⅠ的酶切位点［3］，两位点位于基因外显子处，单核苷酸的变化导致表达的维生素D受体蛋白异常，进而影响Vit D功能的正常发挥［4-5］，从而对结核的易感性产生一定影响。目前，有关VDR基因多态性与该地区肺结核易感性的相关报道较少，值得进一步研究。

聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）可用于检测单核苷酸位点碱基的变化，且该方法简便，分型时间短，实验可在常规实验室完成。病例-对照研究方法可通过某研究因素在病例组和对照组之间的分布差异，探究研究因素与疾病发生之间的关联性，也是用于探索疾病的危险因素和病因的常用分析流行病学方法。为此，本研究以病例-对照研究方法为基础，采用PCR-RFLP探讨VDR-TaqⅠ、FokⅠ位点基因多态性与宁夏人群肺结核发病的关系。为今后确定高危人群、肺结核的预防和治疗等奠定基础，提供可靠依据。

材料和方法

一、研究对象和实验材料

1.研究对象：病例组来源于宁夏西吉、海原、泾源、彭阳、原州、同心、中卫、隆德8个地区，并且在该地区居住10年以上的患者。2010年7—11月，按照结核病诊断标准［6］，经8地区的疾病预防控制中心相关专家确诊的肺结核患者。纳入标准：年满18周岁，痰涂片或分离培养阳性，胸透X线片显示结核征象，有临床表现，咳嗽或咯痰2周以上或咯血；排除标准：伴有糖尿病、高血压、哮喘、慢性阻塞性肺结核病、肺癌等并发症，排除HIV、肝炎病毒感染，肿瘤患者及长期使用激素和器官移植等使免疫功能低下者。

对照组为同期选择的，来源于该8个地区的健康人群，与纳入患者性别相同，民族相同，年龄相当的同乡。纳入标准：年满18周岁，无结核病，排除标准同病例组。

根据前期回顾性调查，宁夏南部地区登记的肺结核病的年患病率，估计每年为500/10万～700/10万。以α=0.05，β=0.5～0.8，样本量至少应该≥1800才具有检验效能为50%～80%。具体由：http：// pngu.mgh.harvard.edu/～purcell/gpc/cc2.html，计算所得。

共收集标本1873份。其中，病例组993例，其中男550例，女443例；汉族413例，回族580例；18～75周岁，平均年龄（48.4±18.2）岁。对照组经排查后，符合要求的为880名，其中男485名，女395名；汉族359名，回族521名；18～75周岁，平均年龄（46.8±16.6）岁。最后分析时，剔除无实验结果的样本后，TaqⅠ位点病例组982例，对照组872例，FokⅠ位点病例组976例，对照组861例。因调查地区汉族与回族通婚频繁，民族血统不纯正，最后分析时，未考虑民族对实验结果的影响。

病例组和对照组性别构成差异无统计学意义（χ2=0.14，P=0.91），年龄构成差异无统计学意义（t=1.91，P=0.06）。

2.仪器设备：制冰机：宁波格兰特制冷设备制造有限公司XB70；低温高速离心机：美国贝克曼库尔特商贸有限公司TJ-6；核酸蛋白分析仪：Thermo NANODROP 2000；PCR仪：BIO-Cyclery；凝胶成像仪：BIO-RAD Image Lab 3.0。电泳仪：北京市六一仪器厂DYY-6C；电泳槽：北京市六一仪器厂DYCP-31DN。

3.试剂耗材：10%十二烷基磺酸钠（SDS）：Sigma公司生产；Proteinase K（Sigma ALDRICH Lot# 080M8609V）：Sigma公司生产；RNase A（Cat No.12091-039 Lot：1253939）：Invitrogen公司生产；PCR试剂（Promega Go Taq Colorless Master Mix）：Promega公司生产；FokⅠ（D1046B）：TaKa-Ra（大连）宝生物工程；TaqⅠ：Promega公司生产。

二、方法

（一）调查方法

所有参加者为自愿参加，并签署《知情同意书》。对所有参加者提供免费的一般性的临床检查和一次乙型肝炎（简称“乙肝”）全套检查和肝功能检查。随后进行一对一的问卷调查填写《肺结核易感性调查登记表》，调查表主要由澳大利亚结核研究所课题组Ellis博士和昆士兰医学研究所的Mc Manus教授和杨玉荣教授商定，调查人员为各县市CDC结核病防治所相关负责人员，工作开展前对调查人员在宁夏医科大学集中2 d培训，收集标本的过程中集中讨论遇到的问题及解决办法。调查内容除基本信息（姓名、性别、年龄、民族、家庭住址、联系方式等）外，还包括结核既往史、卡介苗接种史、乙肝史、其他疾病史。同时用一次性抗凝采血管抽取静脉血5 ml，-80℃冻存备用。在标本收集初期课题组人员现场跟踪收集标本的全过程，所收集标本暂时存放于各县市CDC实验室的-20℃或-80℃冰箱中，每个月集中送往宁夏医科大学实验室检测。

（二）检测方法

1.基因组DNA提取：采用裂解红细胞法［7］，低渗溶解红细胞，离心收集白细胞，以10%SDS裂解白细胞，以Proteinase K消化蛋白，以RNase A降解RNA，以异丙醇和乙醇抽提和洗涤DNA，最后以1×Tris-EDTA buffer（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，p H=8.0）溶解基因组DNA。用核酸定量仪测量DNA的纯度和浓度。1.8＜A260/A280＜2.0，则DNA纯度符合要求。

2.PCR扩增：采用在线引物设计软件Primer 3设计引物（TaqⅠ：上游5′-CTAAATGCACGGAGAAGTCACTG-3′，下游5′-TTCTGGATCATCTTGGCATAGAG-3′；FokⅠ：上游5′-AGCTATGTAGGGCGAATCATGT-3′，下游5′-TCCAAGAGAGTCAGAGGAACATC-3′），由Invitrogen公司合成。采用96孔板进行PCR反应，TaqⅠ位点PCR反应体系25μl：Master Mix 12.5μl，上/下游引物各0.5μl（5 pmol），模板2μl（100 ng），无核酸酶水9.5μl。循环条件：95℃预变性2 min，95℃变性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环，72℃总延伸5 min。FokⅠ位点PCR反应体系25μl：Master Mix 12.5μl，上/下游引物各0.5μl（5 pmol），模板1μl（50 ng），无核酸酶水10.5μl。循环条件：95℃预变性2 min，95℃变性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30个循环，72℃总延伸5 min。扩增产物采用2%的琼脂糖凝胶［溴化乙锭（EB）浓度0.5μg/ml］，电压120 V，1 h电泳检测，可用。

3.酶切分型：以DNA含量较多的样本进行酶切作用预实验，确定酶切反应时酶的浓度、酶切作用的温度和时间、电泳分型凝胶的大小，电泳电压和时间，选取用于检测酶切作用效果的控制标本1（C1）和控制标本2（C2）。C1为ttff基因型，酶切后TaqⅠ位点2个片段（219 bp、102 bp）、FokⅠ位点3个片段（345 bp、156 bp、63 bp）；C2为TtFt基因型，酶切后TaqⅠ位点3个片段（321 bp、219 bp、102 bp）、FokⅠ位点4个片段（408 bp、345 bp、156 bp、63 bp）。以最佳反应条件用于实验。

采用96孔板进行酶切。每板添加C1、C2、无菌水各一个。酶切作用后C1、C2、无菌水均符合理论结果，该板结果可用，否则重新试验。TaqⅠ位点酶切体系：PCR产物7μl，TaqⅠ酶0.5μl（5 U），BSA 2μl，Buffer E 2μl，补无菌水到20μl，37℃酶切3 h。FokⅠ位点酶切体系：PCR产物9μl，FokⅠ酶（TaKaRa公司）0.5μl（5 U），10×M 2μl，BSA 2μl，补无菌水到20μl，37℃酶切2 h。酶切产物取10μl，以50 bp或100 bp DNA Marker为对照，采用3%的琼脂糖凝胶，120 V，1 h，电泳检测。

酶切分型：VDR-TaqⅠ位点若为等位基因T，则PCR产物中不存在TaqⅠ酶切位点，酶切产物为321 bp 1个片段，若为等位基因t，则存在一个酶切位点，酶切产物为219 bp、102 bp 2个片段，因此，酶切后可产生三种基因型TT（321 bp），Tt（321 bp、219 bp、102 bp）和tt（219 bp、102 bp）（图1）。VDRFokⅠ位点若为等位基因F，则PCR产物中有一个酶切位点，酶切产物为408 bp、156 bp 2个片段，若为等位基因f，PCR产物有两个酶切位点，酶切产物为345 bp、156 bp和63 bp 3个片段，酶切后可产生FF（408 bp、156 bp），Ff（408 bp、345 bp、156 bp、63 bp）和ff（345 bp、156 bp、63 bp）3种基因型（图2）。

1、2、3、M分别表示tt、TT、Tt基因型和100 bp Marker 图1 VDR-TaqⅠ酶切电泳图片

1、2、3、M分别表示ff、Ff、FF基因型和50 bp Marker 图2 VDR-FokⅠ酶切电泳图片

（三）数据统计

采用双人平行录入法，由两人同时将数据以Excel表格形式录入计算机，并进行一致性核对，确保数据输入无误。采用SPSS 16.0统计软件进行数据统计。病例组与对照组一般情况进行均衡性比较；进行Hardy-Weinberg遗传平衡检测；各基因型与肺结核的相关性采用χ2检验，为排除混杂因素的影响，进一步分析采用多因素logistic回归分析。OR值表示病例组与对照组的优势比，OR=1，说明变量对疾病不起作用，OR＞1，说明变量是危险因子，反之是保护因子。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

（四）所用公式

基因型频率（观测值）：通过测定群体中某种基因型在该群体中所占的率。

等位基因频率（观测值）：通过测定群体中某种等位基因在该群体中所占的率。

基因型频率（期望值）：根据Hardy-Weinberg平衡定律计算的某种基因型在该群体中所占的率。

即（PT十Pt）2=PT2十2·PT·Pt十Pt2=1，TT基因型频率PTT=PT2；

TT基因型频数：=N·PTT；

Tt基因型频率PTt=2·PT·Pt；

Tt基因型频数=N·PTt；

tt基因型频率Ptt=Pt2；

tt基因型频数=N·Ptt；

N为该二倍体个体总数。

结 果

1.Hardy-Weinberg平衡分析：经遗传平衡检测，VDR-TaqⅠ两多态性位点基因型频数在病例组和对照组人群之间的分布与Hardy-Weinberg定律的理论分布差异无统计学意义（χ2=0.046，P= 0.83），说明所选取的样本来自遗传平衡状态的人群。VDR-FokⅠ位点经检测（χ2=5.166，P= 0.02），可能是由于样本数量太小造成（表1）。

表1 对照组VDR-TaqⅠ、FokⅠ位点基因型分布Hardy-Weinberg平衡检测

2.基因型、等位基因在病例组和对照组分布：结果显示，除VDR-TaqⅠ位点基因型分布在病例组和对照组中差异有统计学意义外（P＜0.05），其余基因型和等位基因在病例组和对照组中的分布频率差异均无统计学意义（P＞0.05，表2、3）。

3.基因型模型在病例组和对照组中的分布：根据肺结核的发生与等位基因显隐性及基因型纯合度的关系，可将理论上控制表型的VDR-TaqⅠ、FokⅠ位点的基因型分为以下几类：TaqⅠ位点的碱基T为显性基因、FokⅠ位点的碱基C为显性基因，则TaqⅠ、FokⅠ位点基因型可依次分为TT十Tt、tt，FF十Ff、ff两类；若TaqⅠ位点的碱基T为隐性基因、FokⅠ位点的碱基C为隐性基因，则两位点基因型可依次分为TT、Tt十tt，FF、Ff十ff；若表现与基因纯合度有关，则两位点基因型一次分为TT十tt、Tt，FF十ff、Ff两种基本类型（表4）。

TaqⅠ位点显性基因模型中，TT十Tt、tt基因型病例组和对照组分布频率分别为98.2%（964/982）、1.8%（18/982）和99.4%（867/872）、0.6%（5/872），TT十Tt基因型对比tt基因型是结核的保护因子，OR（95%CI）：0.98（0.978～0.997）；FokⅠ位点纯合基因模型中FF十ff、Ff基因型在病例组和对照组分布频率分别为52.0%（508/976）、48.0%（468/976）和46.7%（402/861）、53.3%（459/861），FF十ff基因型对比Ff基因型人群罹患肺结核的风险增加，OR（95%CI）：1.12（1.023～1.298）。其他基因型模型在病例组和对照组中分布差异无统计学意义（表4）。

表2 两组中VDR-TaqⅠ、FokⅠ位点基因型、等位基因的分布

表3 两组中VDR-TaqⅠ、FokⅠ位点等位基因的分布

表4 基因型模型在病例组和对照组中的分布

续表4

4.多因素logistic分析：为排除性别、年龄、民族对结果的影响，以是否发病为因变量，以各种基因模型为自变量，进行多因素非条件logistic回归分析（表5），结果显示VDR-（TT十Tt）基因型可能是结核的保护因子（OR=0.307，95%CI=0.113～0.833），VDR-（FF十ff）基因型可能是罹患肺结核的危险因子（OR=1.242，95%CI=1.031～1.495）（表6）。

表5 不同变量的多因素非条件logistic回归分析赋值表

表6 多因素logistic分析结果

讨 论

世界卫生组织调查显示，中国是结核第二高发区，仅次于印度。为控制肺结核的疫情，我国已做过5次全国范围内的肺结核流行病学抽样调查。据2010年调查显示，肺结核防治工作取得显著成效，全国肺结核患病率呈下降趋势，但是疫情仍然非常严重［8］。全球约有1/3人口感染结核分枝杆菌，其中约10%的人最终发展为结核病患者［9］，提示感染结核分枝杆菌后，结核病的发生除自身免疫状态、环境因素外，可能还与机体的遗传状态有关。目前已发现的结核易感基因有HLA和非HLA基因两大类，在非HLA基因中，VDR基因作为侯选基因受到颇多的关注。

关于VDR基因多态性与结核易感性的关联性，已有大量国内外学者进行过相关研究，但是研究结论有较大差异。Wilkinson等［10］对古吉拉特族人的研究显示VDR-TT/Tt基因型和VDR-ff基因型合并Vit D缺失是罹患结核病的危险因素。Merza等［11］对伊朗患者、Lombard等［12］对南非人群的研究显示，VDR基因多态性与结核患病无关。Lewis等［13］进行的Meta分析也显示该基因多态性与结核患病无关。王喜等［14］研究显示VDR-TaqⅠ、FokⅠ位点多态性与新疆维吾尔族人群结核易患性无关。李春 柱等［15］针 对 新 疆 哈 萨 克 族 人 群 研究 显 示VDR-ff基因型是罹患结核病的危险因素，赵真真、Gao等［16-17］的研究也显示VDR-ff基因型是罹患结核病的危险因素。高玉婧等［18］对宁夏人群的研究显示FokⅠ位点多态性与结核患病无关。但是，此次针对宁夏人群的研究显示，VDR-TaqⅠ、FokⅠ位点多态性与结核易感性有关，在显性基因模型中，（TT十Tt）基因型可能是结核的保护因子，tt基因型可能是罹患结核病的危险因素，在纯合基因模型中VDR-（FF十ff）基因型可能是结核的危险因素，在排除混杂因素后差异仍有统计学意义，与以往研究有差别。

研究结论不同的原因可能是肺结核的发生是由多基因控制的，单个位点对其作用不明显；不同的地区和民族之间存在差异；受研究条件所限，选取的样本较少或较片面，可能造成一定程度的结果差异。关于VDR基因多态性与肺结核发病之间的真正关系，该基因与环境因素、其他易感基因之间的交互作用尚需进一步加强研究。

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Genetic polymorphisms in VDR-Taq I and VDR-Fok I and susceptibility to tuberculosis among different populations in Ningxia,Peoples'Republic of China

CHEN Dan-dan*，ZHU Gui-na，GUAN Guang-yu，Magda Ellis，Donald P.McManus，YANG Yu-rong.*Human Pathogen and Immunology Department，Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，China

YANG Yu-rong，Email：yangyurong@hotmail.com

Objective This study aimed to explore the relationship between SNP polymorphisms in TaqⅠand FokⅠin the Vitamin D Receptor（VDR）gene and susceptibility to pulmonary tuberculosis（PTB）among the populations in Ningxia Hui Autonomous Region（NHAR），P.R.of China.Methods The confirmed 993 PTB cases（550 males and 443 females）were recruited in different TB clinics of southern NHARin 2010，who had been diagnosed according to WHO TB-diagnosis criteria，without any other co-infections.The 880 healthy matched controls，including 485 males and 395 females were recruited to match the sex，nationality，age and residential area of the TB cases.The detection of two SNPs（TaqⅠ，FokⅠ）in the VDR gene was demonstrated by use of polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism（PCR-RFLP）analysis.All data were entered into the SPSS 16.0 software package.The population data were tested by the Hardy-Weinberg method and then multiple logistic regression models were used for further investigation of the risk gene SNPs in different genetic models，and included covariates that had shown association with disease in the univariate analysis.The significance value was de-termined within 95%confidential intervals with P＜0.05.Results The genotype frequencies of VDR-TT，Tt and tt were 83.0%（815/982），15.2%（149/982），1.8%（18/982）and 84.7%（739/872），14.7%（128/872），0.6% （5/872）in the case and control groups，respectively，with significant difference（χ2=6.15，P=0.046）.The genotype frequencies of VDR-FF，Ff and ff were 32.4%（316/976），47.9%（468/976），19.7%（192/976）and 28.5% （245/861），53.3%（459/861），18.2%（157/861）in the case and control groups，respectively，without any significant differences between the case and control groups.The genotype frequencies in the dominant model of VDR-（TT十Tt），tt were 98.2%（964/982），1.8%（18/982）and 99.4%（867/872），0.6（5/872）in the case and control groups with significantly different value（χ2=5.98，P=0.014）and an OR（95%CI s）of 0.98，3.19（0.978-0.997，1.193-8.574）.The genotype frequencies in the heterozygote model of VDR-（FF十ff），Ff were 52.0% （508/976），48.0%（468/976）and 46.7%（402/861），53.3%（459/861）in cases and controls，with significant value（χ2=5.27，P=0.022）and an OR（95%CI s）of 1.12，3.19（1.023-1.298，0.822-0.985）.Conclusion The VDR TaqⅠand FokⅠpolymorphism was associated with susceptibility to human pulmonary tuberculosis amongst Ningxia Populations.The genotype of the VDR-（FF十ff），tt showed a potential association with risk factors to human pulmonary tuberculosis in the study population groups.The genotypes of the VDR-（TT十Tt）and Ff may be associated with increased resistance to disease.

Tuberculosis，pulmonary/genetics； Receptors，calcitriol； Polymorphism，single nucleotide；Genetic predisposition to disease； Case-control studies； Ningxia

2013-04-24）

（本文编辑：张晓进）

NHMRC（National Health Medical Research Councils，APP1025166）

750004银川，宁夏医科大学病原生物学与免疫学系［陈丹丹（研究生）、朱圭娜（研究生）、杨玉荣］；宁夏疾病预防控制中心研究所（关光玉）；澳大利亚新南威尔士州结核研究所（Magda Ellis）；澳大利亚昆士兰医学研究所传染病研究部（Donald P.McManus）

杨玉荣，Email：yangyurong@hotmail.com