动物抗菌肽基因工程表达研究进展

徐 敏，余 娟，贺会利，陈明艳，魏小兵，陈玲丽，胡建和，刘兴友

（河南科技学院动物科学学院 动物病毒防控与药残分析河南省重点学科开放实验室农产品质量安全系统控制河南省高校教育部重点实验室培育基地动物疫病和残留防控河南省高校工程技术研究中心，河南 新乡453003）

抗菌肽是一种具有广谱抗菌活性的多肽，它也是动物防御系统产生的一类对抗外源性病原体致病作用的防御性肽类物质。一般由20～60个氨基酸残基组成，分子量在2 000～7 000Da左右。抗菌肽合成的速度非常快，肽键合成速度比IgM快100多倍［1－2］，致使机体在受到损伤或者病原微生物入侵时能迅速产生抗菌肽杀伤入侵者。所以抗菌肽又被称为是机体理想的第一道防线。自从20世纪70年代首先由瑞典的科学家Boman H G在用大肠杆菌诱导惜古比天蚕分离到第一个真正意义上的抗菌肽－天蚕素（cecropin）以来，此后人们相继又在两栖类、昆虫、水产动物及包括人在内的哺乳动物甚至植物及细菌等广泛的生物谱中发现了1 700余种抗菌肽［3］。多数抗菌肽具有优良的广谱抗菌性能，对于革兰阳性菌和阴性菌都表现出良好的抑菌和抗菌效果；抗菌机理不同于抗生素，对真核细胞几乎没有作用，仅作用于原核细胞，同时不易使病原菌产生耐药性；并且对于一些真菌、病毒、原虫和肿瘤细胞都有一定的杀伤作用，相对于抗生素具有效价高、无残留等特点，因此一直受到各国学者的广泛关注。随着基因工程技术的迅速发展，抗菌肽在体外克隆和转载表达等研究也得到很好的发展，各种转抗菌肽基因动植物及其产品相继问世，为抗菌肽的大规模生产利用提供一条广阔的道路。因此如何更好的开发利用好抗菌肽这一资源，使之为人类健康服务，已受到越来越多的重视。

天然抗菌肽在生物体中含量较低，所以从生物体内直接分离提取的难度大；而化学合成的抗菌肽表现出与天然抗菌肽一致的生物活性，但对技术和成本的要求高，不宜产业化生产，限制了其应用；抗菌肽的来源成为制约其发展的关键。基因工程技术的快速发展，极大促进了抗菌肽的开发和研究，利用基因工程方法异源表达抗菌肽是一种相对较经济的方法。人们在利用原核表达和真核表达系统制备抗菌肽的过程中进行了种种尝试，取得了许多进展。本文主要对抗菌肽在大肠杆菌、杆状病毒和毕赤酵母表达体系的研究进展进行简要综述，以期为其规模化生产利用提供参考和借鉴。

1 动物抗菌肽在大肠杆菌中的表达

大肠杆菌的表达系统是迄今在基因工程领域中研究应用最多、最完善的原核表达系统。而该系统广泛应用于抗菌肽表达的是pGEX系列和pET系列的表达载体，用两者进行基因工程表达均具有操作简单、培养成本低、周期短等特点。pGEX系列的表达载体提供的是GST标签，可以增加目的蛋白的溶解度，容易表达形成可溶的GST融合蛋白，便于亲和层析快速纯化，能维持目的蛋白的高级结构和生物学活性，融合的GST可选用因子Xa或凝血酶去除，使目的蛋白容易切下来，但缺点是可溶性蛋白易受细菌内蛋白酶的作用而降解；pET系列的表达载体在原核蛋白表达中应用最多，具有许多同样的限制性酶切位点，还能提供不同的融合标签如His·Tag标签、GST标签、T7·Tag标签及表达系统配置，能够应用于不同类型的异源蛋白表达。

Moon等［4］以pGEX－4T－3为载体，在大肠杆菌BL21中以与GST融合的方式表达了具有α-螺旋结构的37个氨基酸残基的人杀微生物肽（humancathelicidin）LL－37，目标蛋白用因子Xa切割下来，再用RP－HPLC进行纯化，最后获得了0.3mg/L的产量，可以满足针对该蛋白结构等方面的基础研究。赵晓宇等［5］通过人工合成的方法获得抗菌肽Lactoferricin B基因的优化序列，并将其成功构建到pGEX－4T－2表达载体上，转化至大肠杆菌Rosetta（DE3）宿主菌中。经IPTG诱导，结果表明Lactoferricin B在大肠杆菌中的表达量超过20%以上，表达的蛋白多为可溶性形式，并对金黄色葡萄球菌具有明显抑菌活性，为人们使用基因工程技术制备抗菌肽LfcinB提供了具有重要参考价值的技术路线和理论依据。王庆丰等［6］根据大肠杆菌偏爱密码子设计合成鲶鱼抗菌肽Parasin I，成功克隆到pGEX－4T－1中，以大肠杆菌BL21为工程菌进行表达，纯化后的融合蛋白对革兰阳性的金黄色葡萄球菌有抑菌作用，为进一步研究Parasin I及其相关抗菌肽抗菌、抗肿瘤作用奠定了基础。Chen等［7］从蚕幼虫中扩增出Cecropin A成熟肽基因，并将其成功构建到大肠杆菌表达载体pET－32a（＋）上，与表达载体中的Thioredoxin基因构成融合基因，最后经异丙基－β－D硫代半乳糖苷诱导，可表达Cecropin A成熟肽，说明使用该表达系统可以获得天然Cecropin A成熟肽。付登峰［8］将类牛源LNK－16抗菌肽三串联成功地构建到表达载体pET－30a（＋）中，通过诱导条件的优化，确定最佳诱导表达条件为37℃、IPTG浓度0.5mmol/L诱导10h，其表达量占菌体总蛋白的32.6%，并且以包涵体的形式存在，结果显示纯化后的表达产物对大肠杆菌有抑菌活性。刘诚等［9］将抗菌肽 Dermadistinctin－K 成 功 地 构 建 到 pET－32a（＋）中，并通过微量稀释法测定经过肠激酶酶切的融合蛋白对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、猪链球菌、炭疽杆菌均具有抑菌活性，而未经肠激酶酶切的融合蛋白未表现出抑菌活性。胡功铃等［10］成功将杂合抗菌肽HMCM基因克隆到的大肠杆菌表达载体pET－32a－c（＋）中，并在大肠杆菌 BL21（DE3）中获得成功表达，其表达产物经EK酶酶切后对枯草芽孢杆菌有明显的抑菌作用，而对大肠杆菌则没有抑菌作用。Luo等［11－12］将Plectasin抗菌肽的编码序列优化，成功地克隆到表达载体pET－32a（＋）中，最后以Trx－融合蛋白形式获得表达，切割Trx－tag标签后，检测结果表明表达产物对金黄色葡萄球菌有抗菌活性。

无论哪种原核表达载体都还存在一些避免不了的缺点，如不能对表达的蛋白质进行翻译后修饰，对重组蛋白的活性会有一定的影响。另外，在某些情况下，大肠杆菌表达的蛋白质可能会形成不溶性的包涵体，必须经过变性、复性等繁琐的操作处理后才能应用。大肠杆菌产生的内毒素也难以除去，导致产物纯化困难。为了克服上述缺点，许多学者将原核基因调控系统引入到真核基因调控领域中。

2 动物抗菌肽在杆状病毒中的表达

近几年出现的适用范围广、表达效率高的杆状病毒表达系统也是抗菌肽基因工程表达系统中一种重要的表达体系。杆状病毒中用于表达抗菌肽的表达系统主要是利用Bac－To－Bac杆状病毒系统，使用这个系统产生的重组杆状病毒与使用同源重组产生重组杆状病毒所需要的4周～6周相比，鉴别纯化重组病毒少于2周；同时减少了从斑点筛选重组病毒DNA所包含亲缘和非重组病毒的几率；并且能够快速进行大量重组；适合表达一些功能性研究的蛋白。

Tanaka［13］将编码牛乳铁蛋白（bLF）的基因插入杆状病毒转移载体，然后分离表达bLF的重组病毒，使用抗bLF的单克隆抗体从重组的杆状病毒中检测到约80ku的bLF相关蛋白，并证明rbLF在氮末端含有糖蛋白结合位点，与天然的bLF一样，佐普夫杆菌（Protothecazopfii）对rbLF也较敏感。赵昆等［14］将牛抗菌肽 Bac7－Bac5－βdefense串联基因克隆到BAC－TO－BACTM重组杆状病毒表达系统的pFAST HTb载体中，构建了重组转座载体pFASTBac－Bac7－Bac5－βdefense，转 DH10Bac大肠杆菌（Escherichiacoli）感受态细胞，PCR方法筛选阳性菌落，抽提大分子质粒DNA，获得重组杆状病毒穿梭载体 Bacmid－Bac7－Bac5－βdefense，转染Sf9细胞出现病变后，收集含有重组病毒颗粒的培养上清，通过SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定可见表达的融合蛋白分子量大小为20Kd，表达量约占细胞总蛋白的10.6%。体外抑菌试验表明，重组的rBac7－Bac5－βdefense蛋白对大肠杆菌BL21具有抑菌活性。杨斯琦等［15］成功地将镰形扇头蜱体内的抗菌肽M50的全长基因克隆到Bac－To－Bac杆状病毒系统中，结果表达出来的重组蛋白能被抗原核表达的M50蛋白血清识别，也能被标签His单抗识别。许丹等［16］将shivala基因克隆到杆状病毒转座载体pBacFast－Dual中，转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，通过蓝白斑筛选得到重组杆状病毒DNA，以脂质体介导法转染Sf9细胞，待细胞病变出现后，收集上清液从而获得重组杆状病毒。结果抑菌试验表明，表达的shivala多肽对大肠杆菌（DE3菌株）具有抑菌活性。

与大肠杆菌表达载体相比，杆状病毒表达载体具有操作相对简便、而且昆虫细胞较易培养且成本低、外源基因表达量高，具有与哺乳动物细胞相似的蛋白翻译后修饰功能。但这种修饰有一定限度，虽然其糖基化位点与在哺乳动物细胞中一样，但寡糖链的性质有所不同，无法产生复杂的糖基侧链，这可能是由于昆虫细胞不能将成熟糖链加工成哺乳动物细胞中那样的形式。因此，在使用杆状病毒载体表达某些抗原时无法保持其天然状态。另外用该系统表达的抗菌肽种类比较少，可能与杆状病毒宿主范围较狭窄有关。

3 动物抗菌肽在毕赤酵母表达系统

酵母是一种单细胞低等真核生物，其兼有原核生物和真核生物的特点，近年来应用最广泛的是巴斯德毕赤酵母，它是一种能高效表达重组蛋白的表达系统，在DNA重组技术中得到越来越广泛的应用。巴斯德毕赤酵母表达系统具有的优点是：毕赤酵母表达载体是以整合型载体为主，外源基因通过质粒整合到毕赤酵母基因组中，这样得到的基因工程菌株比较稳定，糖基化程度低。常见的整合型载体又分为胞内表达载体和分泌表达载体。胞内表达通常适合于在胞浆中表达不含二硫键的非糖基化蛋白，虽比胞外分泌水平高，但产物纯化相对复杂；胞外分泌表达的外源蛋白纯化非常方便，所以分泌表达载体倍受青睐。

Hong等［17］运用毕赤酵母表达系统表达了人皮肤抗菌肽 LL－37，该基因装载于 pGAPZ－E/LL－37载体，转染毕赤酵母X－33，经甲醇诱导表达，结果目的蛋白以分泌的形式表达，产物纯化后对藤黄微球菌（Micrococcusluteus）具有抗菌活性。该研究表明，抗菌肽可以通过酵母真核表达系统表达，而不必与其他蛋白融合。江学斌等［18］成功实现了抗菌肽Cecropin AD基因在毕赤酵母X－33中的组型表达pGAPZαA，表达后的蛋白对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等均具有明显的抑杀作用，抗菌肽的组成型表达方法得到了成功应用，为以后的规模化生产和应用奠定了基础。徐婉芳等［19］将拟穴青蟹抗菌肽scygonadin基因成熟肽片段构建到酵母表达载体pPIC9K中，通过电击转化至毕赤酵母GSl15，经筛选和鉴定证实了目的基因已稳定整合入酵母基因组中。以甲醇诱导表达阳性克隆，上清中表达产物经过Tricine－SDS－PAGE鉴定与预期的目的蛋白大小（约10ku）相符，并利用琼脂扩散试验证明，表达产物能抑制革兰阳性菌和革兰阴性菌的生长，对酵母和真菌没有抑制作用，说明毕赤酵母表达系统更容易使表达产物具有生物活性。李青等［20］根据毕赤酵母密码子的偏爱性，将一种新型食品生物防腐剂－多聚阳离子抗菌肽（PCAP）连接克隆到酵母表达载体pPIC9并转化到毕赤酵母GS115，用0.5%甲醇诱导表达，通过Tricine－SDS－PAGE分析该融合蛋白已成功地在毕赤酵母中表达。在pH值2条件下将表达产物采用胃蛋白酶酶解，分离得到的碱性多聚阳离子肽对食品腐败微生物枯草芽孢杆菌具有明显的抑菌作用。刘德辉等［21］成功的将蚕新型抗菌肽Cryptonin克隆到pPICZAα－C质粒中，获得的重组酵母表达载体通过SacⅠ酶切线性化后，电转化至X－33中，PCR检测Cryptonin基因与毕赤酵母染色体稳定结合，Zeocin抗性筛选得到高拷贝转化子，在AOX1启动子的调控作用下获得分泌表达产物Cryptonin蛋白，且表达产物耐热性强，在100℃条件下10min内抗菌活性不变，煮沸30min以上仍具有活性，表达产物经琼脂糖扩散检测对革兰阳性菌和革兰阴性菌都具有很好的抑菌活性，为抗菌肽的分子设计和进一步大量生产研发新型抗菌药物奠定了一定的基础。Wang等［22］将杂合抗菌肽CECA－MAG及其突变体的合成在毕赤酵母中成功地分泌表达，表达产物能够抑制大多数革兰阳性菌和革兰阴性菌的生长。Tang等［23］运用毕赤酵母表达系统表达了牛 Lactoferrampin－Lactoferricin（LFALFC）抗菌肽，将该基因装载于pPICZαA－LFA－LFC载体，电转化于KM71，甲醇诱导表达，结果目的蛋白以分泌形式表达经纯化后对大肠杆菌有较强的抑菌活性。

目前在抗菌肽基因工程表达中应用最多的是分泌型表达载体pPICZα的3个类型、pGAPZα的3个类型和pPIC9K进行酵母表达，相比而言这些载体的相同点是都具有分泌效率高的α－factor，不仅能对宿主细胞的代谢负荷有所减轻，还可以减少宿主细胞蛋白水解酶对外源蛋白的降解。在表达载体端启动子序列的下游，均提供外源基因插入的多克隆位点，并且多克隆位点的下游还包含便于检测外源蛋白的myc表位和便于纯化蛋白的多组氨酸标记，以及有利于mRNA的稳定AOX1 3′端终止序列。不同的是，pPIC9K属于酵母菌和大肠杆菌的穿梭质粒，带有氨苄基因，转入大肠杆菌感受态细胞要用Amp抗性筛选，转入毕赤酵母感受态细胞要先用His缺陷筛选阳性克隆，再利用G418筛选多拷贝；而pPICZα的3个类型和pGAPZα的3个类型的载体均具有Zeocin抗性筛选标记基因，重组转化子可直接用Zeocin进行筛选，即在YPDZ平板生长的转化子中，100%都有外源基因的整合，大大简化了重组转化酵母的筛选过程。在操作过程中，Zeocin也可用来筛选含表达载体的大肠杆菌转化子，相比pPIC9K不必另外使用氨苄青霉素，经济而又简单。另外，pPIC9K和pPICZα的三个类型的载体具有较强的可调控启动子AOX1，来严格控制外源基因的表达；而pGAPZα的三个类型的载体则具有不需要甲醇诱导的3－磷酸甘油醛脱氢酶（GAP）强启动子，在宿主细胞中成组型表达。这样就避免了使用有毒的甲醇为诱导原料的缺点，是一种理想的分泌型载体。

综上所述，毕赤酵母及杆状病毒表达系统既具有大肠杆菌表达系统的操作简单，细胞易培养，成本低，表达量高等优点；又具有比大肠杆菌更为完善的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰及分泌能力，并且不会产生内毒素，是基因工程中良好的真核基因受体菌。由于杆状病毒载体表达某些抗原时无法保持其天然状态，且该系统表达的抗菌肽种类也比较少，限制了应用；而毕赤酵母表达系统具有醇氧化酶可调控的强启动子，能高密度发酵，重组蛋白表达量高。同时，对高效分泌表达的外源蛋白，进行翻译后加工处理，将外源蛋白分泌到细胞外，不但提高表达蛋白的活性，且有利于产物的纯化。因此，毕赤酵母表达系统在抗菌肽应用上更为广泛。本课题组也选择了毕赤酵母表达系统，并成功构建了类牛源LNK－16 6串联抗菌肽毕赤酵母表达体系，为类牛源LNK－16 6串联抗菌肽的大量表达奠定基础。

4 展望

随着药物残留，耐药菌株的不断出现，人们意识到有必要开发一类新型的抗生素。而抗菌肽具有广谱的生物活性，杀菌迅速，不受传统的抗生素耐药菌株影响，与典型的抗生素具有协同作用有着抗生素无法比拟的优点成为了人们关注的焦点。虽然利用基因工程的方法来获得抗菌肽的尝试已在原核体系和真核体系获得成功，但是其真正成为一类药物还需要解决一些问题。首先是如何能够提高抗菌肽的生产效率，降低生产成本，提高表达效率，简化提纯方法，更有效地降低抗菌肽表达产物对宿主菌的毒性，还需要我们不断地探索和研究。其次，与传统抗生素比，一些抗菌肽的抗菌活性还不够理想，通过已有的抗菌肽和设计新抗菌肽分子是提高活性的有效途径。这就需要进一步研究抗菌肽结构与活性的关系，为抗菌肽分子的改造和设计提供足够的理论依据。相信随着抗菌肽及基因工程技术在理论和应用上的不断深入研究，抗菌肽会对人类医学产生深远影响。

［1］ Jenssen H，Hamill P，Hancock R E.Peptide Antimicrobial A－gents［J］.Clin Microbiol Rev.2006，19（3）：491－511.

［2］ 包散丹，李海燕.抗菌肽的研究进展［J］.内蒙古科技与经济，2008，160（3）：347.

［3］ Brahmachary M，Krishnan S P，Kohn，etal.Antimic：a database of antimicrobial sequences［J］.Nucleic Acids Res，2004，32（Databae issue）：D586.

［4］ Moon J Y，Henzler－Wildman K A，Ramamoorthy A.Expression and purification of a recombinant LL－37fromEscherichia coli［J］.Biochim Biophys Acta，2006，1758（9）：1351.

［5］ 赵晓宇，冯兴军，孟利强，等.抗菌肽Lactoferricin B的原核表达及其纯化［J］.东北农业大学学报，2010，41（9）：67－71.

［6］ 王庆丰，韩跃武.鲶鱼抗菌肽Parasin I原核表达载体的构建与鉴定［J］.国外医药－抗生素分册，2011，32（6）：279.

［7］ Chen L.Prokaryotic expression of antibiotic peptide Cecropin A gene and identification of expression products［J］.Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research，2011，（15）：4549－4552.

［8］ 付登峰.类牛源抗菌肽LNK－16在大肠杆菌中的串联表达［D］.郑州：河南科技学院，2011：1－10

［9］ 刘诚，黎满香，蒋伟，等.抗菌肽Dermadistinctin－K的原核表达及生物活性鉴定［J］.中国兽医科学，2012，42（05）：517－522.

［10］胡功铃，陈国平，胡宗利，等.杂合抗菌肽HMCM的原核表达及其活性鉴定［J］.药物生物技术，2012，19（1）：6－10.

［11］Jing X L，Luo X G，Tian W J，etal，High－Level Expression of the Antimicrobial Peptide Plectasin inEscherichiacoli［J］.Curr Microbiol，2010，61（3）：19.

［12］Luo X G，Lv L H，Jing X L，etal，Indipendent and Tandem Expression of a Novel Antimicrobial Peptides Plectasin in Escherichia coil［J］.Advanced Materials Research，2012，345：134－138.

［13］Tanaka T，Nakamura I，Kumura H.Expression of bovine lactoferrin and lactoferrin N－lobe by recombinant baculovirus and its antimicrobial activity against Prototheca zopfii［J］.Biochem Cell Biol，2003，81（5）：349－354.

［14］赵昆，刘思国，王春来，等.牛抗菌肽Bac7－Bac5－βdefense串联基因在昆虫杆状病毒系统中的表达及其产物的活性分析［J］.农业生物技术学报，2008，16（3）：380－384.

［15］杨斯琦，周勇志，张厚双，等.抗菌肽M50基因在Bac－To－Bac杆状病毒系统中表达［J］.中国动物传染病学报，2010，18（5）：49－53.

［16］许丹，许信刚，王志昇，等.Shivala基因在杆状病毒中的表达及其表达产物抑菌活性检测［J］.西北农业学报，2011，20（6）：33－37.

［17］Hong I P，Lee S J，Kim Y S，etal.Recombinant expression of human cathelicidin（hCAP18/LL－37）inpichiapastoris［J］.Biotechnol Lett，2007，29（1）：73－78.

［18］江学斌，张敏静，林健聪，等.抗菌肽Cecropin AD在毕赤酵母中的组成型表达及中试发酵研究［J］.饲料工业，2011，32（19）：25－29.

［19］徐婉芳，谢嘉华，陈慧芸.拟穴青蟹抗菌肽scygonadin在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性［J］.泉州师范学院学报，2011，29（6）：11－13.

［20］李青，周晓宏.新型生物防腐剂－多聚阳离子抗菌肽在毕赤酵母中的表达［J］.食品科学，2012，3：1－8.

［21］刘德辉，焦颖，徐蕙，等.蝉新型抗菌肽Cryptonin在毕赤酵母中的分泌表达及活性鉴定［J］.中国兽医学报，2010，30（6）：806－810.

［22］Wang X Q，Zhu M X，Zhang A J，etal.Synthesis and secretory expression of hybrid antimicrobial peptide CecA－mag and its mutants inPichiapastoris［J］.Society for Experimental Biology and Medicine，2012，237（3）：312.

［23］Tang X S，Tang Z R，Wang S P，etal.Expression，Purification，and Antibacterial Activity of Bovine Lactoferrampin－Lactoferricin inPichiapastoris［J］.Appl Biochem Biotechnol，2012，166：640－651.