鸡传染性支气管炎病毒黏膜免疫研究进展

何怡宁，郑衍生，磨美兰

（广西大学动物科学技术学院，广西 南宁530005）

鸡传染性支气管炎病毒（IBV）引起的鸡传染性支气管炎（IB）是一种具有高度传染性的病毒性呼吸道疾病，主要侵害鸡的呼吸系统、泌尿生殖系统和消化系统，不同日龄均能感染，雏鸡最易感。尽管广泛使用疫苗，但IB仍频繁发生［1］。因此，做好IB的预防控制具有极其重要的意义。IBV致病机制的研究是IB防控的主要方向之一，而IBV是典型的嗜黏膜病原，主要通过呼吸道黏膜途径感染机体，因此黏膜免疫研究是IBV致病机制研究的重中之重。黏膜免疫研究可为黏膜疫苗和佐剂的研究提供新思路和方法，为防控IB奠定基础。目前有关学者对IBV感染的黏膜免疫进行了一些初步研究。本文将对IBV感染的黏膜免疫的最新研究进展作一综述，为IBV相关研究提供重要参考。

1 黏膜免疫系统的构成

黏膜由上皮组织和结缔组织构成，覆盖于呼吸道、消化道及泌尿生殖道等部位，与外界环境直接接触，是病原微生物侵入机体的门户。家禽黏膜免疫系统是机体免疫系统不可分割的重要组成部分，也是免疫系统的第一道防线。禽类黏膜免疫系统由黏膜相关淋巴组织（MALT）和弥散性免疫细胞两部分组成，MALT包括鼻相关淋巴组织（NALT）；眼相关淋巴组织（CALT），如哈德尔氏腺；支气管相关淋巴组织（BALT）；肠相关淋巴组织（GALT），如盲肠扁桃体、派伊尔结（PP），按解剖和功能分为诱导部位和效应部位［2］。

诱导部位包括GALT的PP和微皱褶细胞（M细胞）、肠上皮细胞、树突状细胞（DC），以及NALT，CALT和BALT。M细胞不能递呈抗原，主要以受体介导胞吞的方式非特异性摄取和转运抗原。在黏膜相关淋巴组织中接触抗原后，黏膜淋巴细胞离开诱导部位，回到黏膜效应组织发挥作用，而黏膜免疫应答的效应部位分布广泛。效应免疫细胞包括上皮淋巴细胞，固有层淋巴细胞，T细胞、B细胞，巨噬细胞，树突状细胞（DC），肥大细胞和腔内淋巴细胞。此时，DC能捕获抗原但不递呈抗原，而直接调节B细胞反应。

黏膜免疫的主要功能是在黏膜表面向宿主提供局部免疫防御作用，并诱导全身免疫反应，包括固有免疫和获得性免疫。经黏膜部位免疫，如滴鼻点眼等，能同时诱导局部黏膜和系统免疫应答，而经肌肉或皮下注射免疫能引起强烈的系统免疫应答，但几乎不能诱导有效的局部黏膜系统免疫应答。Du［3］等研究发现，与肌肉注射接种相比，经鼻接种引起的全身体液免疫反应强度相当但持续时间较短，局部体液免疫反应更强烈些，同时引起较强的全身和局部的特异性CTL的反应。

2 IBV黏膜固有免疫应答

固有免疫应答是体内固有免疫细胞和分子识别、结合病原体及其产物或抗原性异物后，被迅速活化产生相应生物学效应，将病原体等抗原性异物杀伤、清除的过程。固有免疫在机体非特异性抗感染免疫过程、特异性免疫应答的启动、调节和效应阶段发挥着重要作用。

研究表明，黏膜免疫IBV H120或M41株5d后再感染大肠杆菌，与大肠杆菌单独感染相比，巨噬细胞在感染鸡的气管、肺和气囊部位募集时间更早，感染0.5h后立即出现，数量明显更多，且持续时间更长，第7天才有所降低［4］，说明了IBV感染调节了黏膜固有免疫细胞的应答。

感染IBV后，宿主黏膜部位许多固有免疫相关基因的mRNA表达水平发生变化，表明黏膜固有免疫系统被有效激活。Wang［5］等研究了感染弱毒IBV 3d后鸡气管上皮层的基因转录图谱，发现25个与免疫应答直接相关基因表达上调，包括Toll样受体2（TLR2）、TLR3、干扰素诱导的抗病毒基因（Mx）、免疫调节性细胞因子和趋化因子以及细胞因子受体γ链转录显著增加，说明固有免疫应答在感染早期激活以快速清除局部感染的病毒。Guo［6］等研究发现，首免弱毒IBV后，黏膜组织的一些固有免疫因子、TLRs、视黄酸诱导基因－1（RIG－1）、1型干扰素（IFN－I），白介素1β（IL－1β）和补体等被局部激活。TLR3和RIG－1是感染细胞的RNA感受器，作为双链RNA依赖性蛋白激酶（PKR）能诱导产生IFN－I和促炎性细胞因子。H120或M41分别单独感染宿主，5d后再感染大肠杆菌，发现共感染第1天，宿主肺组织IL－6、IL－8、IFNγ、IL－10和IL－1βmRNA的表达水平与大肠杆菌单独感染的相似或略高，但共感染后第3天，这些细胞因子的mRNA表达水平均高于大肠杆菌单独感染组的水平，特别是M41的感染［7］，表明IBV感染从细胞因子mRNA表达水平，影响了感染鸡体内特定组织对大肠杆菌感染的应答。IBV感染细胞中，促炎症因子IL－6和IL－8表达的提高由p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）诱导，而后期p38MAPK途径受到IBV诱导的双特异性磷酸酶（DUSPs）的调控［8］。

IBV感染还可引起宿主蛋白如细胞因子、补体等参与了黏膜固有免疫对抗IBV感染的应答。脾细胞来源的Ch IFN－I能抑制IBV Gray株在气管环的复制［9］。有关学者运用双向凝胶电泳结合质谱技术，分析人工感染IBV H120疫苗株72小时后，鸡胚气管组织蛋白质组学表达情况，发现了一些与信号转导及免疫相关蛋白，推测蛋白TRIM27.2、泛素羧基酯酶L1表达上调，而Rho GDP解离抑制因子α、炎症相关蛋白热休克蛋白beta－1和膜联蛋白A1表达下调［10］。甘露聚糖凝集素（MBL）以急性期反应的方式在抗IBV感染的固有免疫中起重要作用，它能激活补体，抑制病毒在气管内增殖［11］。

以上研究表明了IBV感染能迅速激活黏膜固有免疫应答，同时黏膜固有免疫系统从细胞、分子及基因水平等多个方面对抗IBV感染。只有当固有免疫被启动后，适应性免疫才会被激活，固有免疫通过多种细胞因子的调控，给适应性免疫提供信息，并决定所需的适应性免疫应答类型。

3 IBV黏膜适应性免疫应答

先天免疫系统的屏障及细胞可溶成分，防止病原体的进入很有效，但往往不能完全抵御病原体并预防疾病，在这一点上，需要特别关注适应性免疫的防御机制，后者不仅消除特定的病原体，并具有免疫记忆，因此可起到预防的作用。根据参与免疫应答细胞种类及其效应机制的不同，可分为B细胞介导的体液免疫应答和T细胞介导的细胞免疫应答。

3.1 体液免疫应答 Kotani［12］等研究了感染IBV雏鸡气管的免疫组织化学及组织病变，发现感染后8小时，黏膜下层出现少数IgG＋，IgM＋和IgA＋细胞，随后IgG＋和IgM＋细胞数量逐渐增加，并在感染后第3天增加显着，第4天达到高峰，第5天后逐渐下降，IgA＋细胞数量较IgG＋和IgM＋细胞少，B细胞主要存在于固有层，感染后14d，少量IgG＋和IgM＋细胞在固有层淋巴滤泡生发中心出现。研究发现，哈德氏腺中SIgA阳性细胞主要围绕各级导管上皮及腺上皮分布，部分浆细胞镶嵌于腺上皮细胞之间，而气管中则主要分布在气管固有膜和黏膜上皮处，经点眼或滴鼻免疫呼吸型IBV弱毒苗均能诱导雏鸡产生较多的SIgA细胞［13］。IBV感染后哈德氏腺中IgM＋淋巴细胞数量增多，共感染传染性腔上囊病病毒第9天IgM＋淋巴细胞显著下降［14］。

经二次和三次免疫IBV核蛋白（NP），鸡鼻腔洗液、气管洗液和肠腔洗液SIgA－NP抗体水平显著提高，而霍乱毒素亚基能显著增强这些部位SIgANP抗体水平［15］。滴眼免疫H120及原核表达IBV rN和rS1，35d收集气管冲洗物，H120免疫组IgA水平显着高于其他组，而IgG水平在所有组中均较低［16］。首免IBV－Mass后，黏膜部位触发B细胞活化和分化的许多重要信号分子基因表达显着上调，随后Igμ链（IgM）及Ig J链，Igγ链激活，二免后立即大幅上升，但没有观察到Igα链（IgA）的激活，实时RT－PCR结果显示Igα链的转录受抑制，因此，IgA可能不是局部抗IBV的一个重要武器，二免后局部IgG 占主导［6］。

经鼻眼接种IBV Gray株后3d至7d外周血和脾脏中出现抗体分泌细胞（ASC），7d至10d ASC数达到最高，比血清抗IBV IgG早出现3d至7d，ASC数量在10d至14d下降，而血清抗体呈上升趋势，血清抗体并没有与临床症状或病毒滴度相关，外周血和脾脏记忆B细胞在3周至10周检测到，脾记忆细胞只有受到抗原刺激后才分泌抗体［17］。

3.2 细胞免疫应答 尽管体液或抗体介导的免疫反应对抗胞外抗原特别有效，细胞介导的免疫反应则专门消除细胞内抗原，包括内吞途径进入细胞的外源性抗原，或是胞内生产的内源性抗原。滴鼻接种H52，15d后用M41攻毒，发现免疫H52后细胞免疫反应和抗体反应同时增强，特异性CTL应答先于血清IgG生成，特异性CTL反应对控制IBV急性感染更重要，感染后期更依赖于抗体，尤其是血清抗体反应［18］。

接种IBV后24h至60h，雏鸡气管的固有层血管周围发现少数CD3＋，CD4＋和CD8＋细胞，3d至4d数量迅速增加，第5天达到峰值，CD3＋，CD4＋和CD8＋细胞分布广泛，感染后第7天CD4＋细胞显著减少，第14天CD3＋，CD8＋细胞数减少，固有层的淋巴滤泡中未发现T细胞［12］。IBV与大肠杆菌混合感染后，气管、肺和气囊的CD4＋和CD8＋T细胞数量显著多于大肠杆菌单独感染组和PBS组［4］。IBV感染后哈德氏腺中CD4＋淋巴细胞数量先增多后减少，共感染鸡传染性贫血病毒CD4＋淋巴细胞显著减少［14］。IBV感染后至少10周可检测到外周血的记忆T细胞，感染3周至6周脾脏收集的IBV特异性CD8＋记忆T细胞可以保护同系雏鸡免受IBV 急性感染［19］。

鸡气管黏膜部位抗原呈递细胞及T细胞相关因子，在首免IBV后基因表达水平上调，局部Th1细胞适应性反应及CTL标记分子颗粒酶A，膜粘蛋白porimin和Fas/FasL的激活，表明早期诱导的CTL反应能有效的清除局部感染的病毒［6］。MBL作为一种具有与补体C1q相似结构的固有模式识别分子，参与调节抗IBV的适应性免疫反应，特异性抗体滴度在低血清MBL鸡中最高，在高血清MBL鸡中甘露糖似乎抑制特异性抗体的生产，另外，疫苗接种或感染后，高血清 MBL鸡中CD4－CD8α＋T细胞减少CD4－CD8α－γδT细胞增加，表明在抗IBV保护中抗体和T细胞具有互补作用［20］。

4 小结与展望

综上所述，IBV入侵黏膜部位后，机体立即从免疫细胞、细胞因子、补体及抗体等多方面应答以对抗IBV的感染。目前，有关IBV感染的黏膜免疫的研究取得了一定的进展，但黏膜局部免疫应答的实际作用及其机制，仍需要进一步研究。有关学者对感染IBV的细胞、鸡胚及鸡气管进行了基因转录组学和蛋白质组学研究，筛选出一些差异表达的分子，但是这些分子在黏膜免疫应答中的具体功能，并以何种途径参与到免疫应答及调节中，是否为IBV感染特有，或是机体对抗病原体共有的，还存在诸多疑问，有待更深层次的研究。因此有必要加强IBV的黏膜免疫研究。

总之，黏膜免疫作为一种更具优势的免疫途径，加上黏膜免疫系统独特的功能，黏膜免疫在抗IBV感染中的重要性越来越受到重视。进一步深入了解IBV感染对黏膜免疫影响的分子机制，将有助于阐明IBV感染的致病机制，为研究黏膜疫苗和佐剂用于IB的防控打下基础。

［1］ Meilan Mo，Baicheng Huang，Ping Wei，etal.Complete Genome Sequences of Two Chinese Virulent Avian Coronavirus Infectious Bronchitis Virus Variants［J］.Journal of Virology，2012，86（19）：10903－10904.

［2］ 张小飞.黏膜免疫佐剂对鸡黏膜和系统免疫反应机理的研究［D］.南京：南京农业大学，2007.

［3］ Lanying Du，Guangyu Zhao，Yongping Lin，etal.Intranasal Vaccination of Recombinant Adeno－Associated Virus Encoding Receptor－Binding Domain of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus（SARS－CoV）Spike Protein Induces Strong Mucosal Immune Responses and Provides Long－Term Protection against SARS－CoV Infection［J］.J Immunol，2008，180（2）：948－956.

［4］ Mieke G R，Matthijs Mark P，Ariaans R，Marius Dwars，etal.Course of Infection and Immune Responses in the Respiratory Tract of IBV Infected Broilers after Superinfection withE.coli［J］.Veterinary Immunology and Immunopathology，2009，127：77－84.

［5］ Xiuqing Wang，Artur J M，Rosa Henrique N，etal.Transcriptome of Local Innate and Adaptive Immunity during Early Phase of Infectious Bronchitis Viral Infection［J］.Viral Immunology，2006，19（4）：768－774.

［6］ Xueshui Guo，Artur J M，Rosa Ding－Geng Chen，etal.Molecular Mechanisms of Primary and Secondary Mucosal Immunity using Avian Infectious Bronchitis Virus as A Model System［J］.Veterinary Immunology and Immunopathology，2008，121：332－343.

［7］ Mark P，Ariaans，Mieke G R，etal.The Role of Phagocytic Cells in Enhanced Susceptibility of Broilers to Colibacillosis after Infectious Bronchitis Virus infection［J］.Veterinary Immunology and Immunopathology，2008，123：240－250.

［8］ Ying Liao，Xiaoxing Wang，Mei Huang，etal.Regulation of the p38Mitogen－activated Protein Kinase and Dual－specificity Phosphatase 1Feedback Loop Modulates the Induction of Interleukin 6and 8in Cells Infected with Coronavirus Infectious Bronchitis Virus［J］.Virology，2011，420：106－116.

［9］ Jianwu Pei，Margaret J，Sekellick Philip I，etal.Chicken Interferon Type I Inhibits Infectious Bronchitis Virus Replication and Associated Respiratory Illness［J］.Journal of interferon and cytokine research，2001，21：1071－1077.

［10］曹中赞.人工感染传染性支气管炎病毒鸡气管和肾脏的蛋白组学分析［D］.哈尔滨：中国农业科学院研究生院哈尔滨兽医研究所，2011.

［11］Helle R，Juul－Madsen Liselotte R，Norup Kurt J，etal.Mannan－Binding Lectin（MBL）Serum Concentration in Relation to Propagation of Infectious Bronchitis Virus（IBV）in Chickens［J］.Viral Immunology，2007，20（4）：562－570.

［12］Takao Kotani，Saeko Wada，Yasuhiro Tsukamoto，etal.Kinetics of Lymphocytic Subsets in Chicken Tracheal Lesions Infected with Infectious Bronchitis Virus［J］.Vet Med Sci，2000，62（4）：397－401.

［13］房慧伶，周华波，王晓丽，等.传染性支气管炎弱毒苗黏膜途径免疫对雏鸡气管及咍德氏腺SIgA细胞分布的影响［J］.中国家禽，2007，29（18）：14－17.

［14］Van Ginkel F W，Van Santen V L，Gulley S L，etal.Infectious Bronchitis Virus In The Chicken Harderian Gland and Lachrymal Fluid：Viral Load，Infectivity，Immune Cell Responses，and Effects of Viral Immunodeficiency［J］.Summarized from Avian Diseases，2008，52（4）：608－617.

［15］杨德全.传染性支气管炎病毒核蛋白黏膜免疫及ELISA检测方法的研究［D］.武汉：华中农业大学，2008.

［16］Rosie Meir，Simi Krispel，Lubov Simanov，etal.Immune Responses to Mucosal Vaccination by the Recombinant S1and N Proteins of Infectious Bronchitis Virus［J］.Viral Immunology，2012，25（1）：55－62.

［17］Jianwu Pei，Ellen W，Collisson.Specific Antibody Secreting Cells from Chickens can be Detected by Three Days and Memory B Cells by Three Weeks Post－infection with the Avian Respiratory Coronavirus［J］.Developmental and Comparative Immunology，2005（29）：153－160.

［18］Guangliang Liu，Qun Wang，Nihong Liu，etal.Infectious Bronchitis Virus Nucleoprotein Specific CTL Response is Generated prior to Serum IgG［J］.Veterinary Immunology and Immunopathology，2012，148：353－358.

［19］Jianwu Pei W，Elwood Briles Ellen W.Collisson Memory T Cells Protect Chicks from Acute Infectious Bronchitis Virus In－fection［J］.Virology，2003，306：376－384.

［20］Helle R，Juul－Madsen Liselotte R，Norup Poul H，etal.Crosstalk between Innate and Adaptive Immune Responses to Infectious Bronchitis Virus after Vaccination and Challenge of Chickens varying in Serum Mannose－binding Lectin Concentrations［J］.Vaccine，2011，29：9499－9507.