杆状病毒在癌症基因治疗方面的应用

骆超超　杨婧如　张妍　陈琛　刘芸菲　王奕　曹锦涛　陈瑶

【摘  要】随着癌症发病率居高不下，人们一直在追求如何能够高效的治疗癌症。随着医药科学的飞速发展，利用基因治疗技术来治疗癌症有了显著成效。基因载体的选择是基因治疗的核心技术之一，杆状病毒一直就是备受关注的一类基因转导载体。经过研究者们的深入研究发现，杆状病毒在肝癌、胃癌、黑色素瘤及脑肿瘤等的基因治疗中具有较强的可行性。目前还可以进一步解决杆状病毒引起的体内补体反应，同时也能不断提高其转导和表达效率。本文将着重介绍杆状病毒在癌症基因治疗中的应用。

【中图分类号】R730.5      【文献标识码】A      【文章编号】1672-3783（2019）03-0073-01

1 杆状病毒

1.1杆状病毒

杆状病毒是节肢动物的病源病毒，具有囊膜的双链环状DNA，且其基因组为单一的闭合环状双链DNA分子，并以超螺旋形式压缩包装。根据包涵体的形态及其理化性质，杆状病毒科被分为核型多角体病毒属（nuclear polyhedrosis virus）、颗粒体病毒属（Granulosis Virus， GV）。核型多角体病毒多用于杆状病毒表达系统的运用。与其他病毒不同的是，在其双向复制的周期中，杆状病毒以两种形态存在：一种是包涵体病毒（occluded virus， OV），是昆虫间水平感染的病毒形式;一种是细胞外芽生病毒（budded virus， BV），是个体内细胞间感染的病毒形式。虽然它们的遗传组成相同，但有着不同的形态、囊膜结构、组成和功能。在时序性的基因表达过程中，在极晚期基因表达的时候，会有两种高效表达的非必需蛋白产生，即多角体蛋白和P10蛋白。正因如此，杆状病毒表达载体系统理想的外源基因插入点是这两个基因位点。

1.2杆状病毒表达系统

杆状病毒载体系统主要分为两大类：一类是用于表达单个外源基因的载体;另一类是多元表达载体，用于插入并表达两个或多个外源基因[1]。一种由研究者开发的通过利用细菌转座子原理的Bac-Bac表達系统重组率几乎为100%，且重组时间迅速^[2]。

杆状病毒表达系统主要应用3个方面：一是应用于生物杀虫剂，二是应用于生物分子的研究;三是应用于医学研究之中，可用于生产疫苗和进行基因治疗。

2 癌症基因治疗

2.1 癌症基因治疗的介绍

癌症的基因治疗就是根据不同癌症的发病机制，利用基因转移技术，通过合适的载体把特异性的外源目的基因片段导入肿瘤细胞中并使其表达，以纠正原有细胞错误或补偿缺陷的基因，从而起到对肿瘤细胞的抑制和杀伤作用，达到治疗癌症的目的^[3]。

2.2 癌症基因治疗的研究

目前的临床研究集中于刺激抗肿瘤免疫反应和直接杀伤肿瘤两个方面： 前者增强抗肿瘤免疫反应是通过转移细胞因子或共刺激因子基因;后者则是通过转移肿瘤杀伤基因。癌症治疗所用的治疗主要有三类：分子化疗、基因免疫、突变补偿。分子化疗是通过转移所谓“自杀基因”而杀灭肿瘤细胞;基因免疫是通过转移细胞因子或共刺激因子基因刺激抗肿瘤免疫;突变补偿是抑制异常的癌基因或诱导抑癌基因表达^[4]。

3 杆状病毒在癌症基因治疗方面的应用

3.1 体内基因治疗

杆状病毒是基因治疗载体的一种，许多传统治疗方法难以治疗的癌症因为癌症基因治疗方法有了新的可能性。研究员在发现杆状病毒介导的癌症基因治疗的可行性后，就在哺乳动物模型中测试了肝癌、胃癌、黑色素瘤及脑 肿瘤等的治疗效果^[5]。例如，Huang及其同事研究发现杆状病毒载体介导的正常上皮细胞特异性-1基因转染可抑制胃癌生长，且证实了该基因治疗对移植瘤裸鼠GC的治疗作用^[6]。王乐瑶构建了携带OriP和Rta基因表达框的重组杆状病毒BV-RO，发现BV-RO只能有效抑制EBV相关肿瘤增殖，不会抑制疱疹病毒科γ亚科的Epstein-Barr病毒（EBV）阴性细胞^[7]。

要绕过与哺乳动物病毒载体相关的一些固有问题需要构建新的杆状病毒载体能，并为癌症基因治疗提供额外的选择^[8]。对于那些对单一疗法有抵抗力的癌症，可以采用联合治疗。Guo及其同事测试了一种结合杆状病毒介导的p53肿瘤抑制基因转移和使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠的策略，测试过程发现了一种新的治疗胶质母细胞瘤的方法——使用杆状病毒介导的基因转移结合组蛋白去乙酰化酶抑制剂^[9]。

3.2 离体基因治疗

离体基因治疗是杆状病毒应用之一，它是指从体内分离出适当的细胞后，在实验室环境用杆状病毒转导，经体外细胞扩增，再移植回体内的过程。Suzuki及其同事在小鼠模型中用离体方法测试表明，杆状病毒转导的骨髓来源的树突细胞（BMDCs），在该模型中可有效抑制肺癌，并且不会引起肝肾功能的损害^[10]。Yin及其同事研究发现感染Bac-GFP的SW1116细胞的存活率显著高于Bac-NIS，表明肿瘤细胞可以被NIS基因介导的131I摄取特异性杀死，证明杆状病毒载体介导的NIS基因治疗是一种治疗结肠癌的潜在方法^[11]。

4 杆状病毒在癌症基因治疗中的应用的优势与劣势

4.1杆状病毒在癌症基因治疗中的应用的优势

杆状病毒作为癌症基因治疗的载体具有的特征符合理想载体的要求。杆状病毒对导入的哺乳动物细胞没有伤害和威胁，安全性高。在哺乳动物细胞中，杆状病毒基因的启动子沉默，基因表达沉默，对转染的哺乳动物细胞不会产生影响^[12]。杆状病毒基因容量大，呈棒状，可延伸，可容纳较大的病毒DNA基因组。目前在一个杆状病毒基因组中最多的可以插入5个外源基因，充分保证了足量性。在病毒基因组中，缺失非必需基因对病毒体复制无影响，所以非必需基因可给插入外源性基因提供了位点^[13]。杆状病毒中的多角体蛋白基因就是一个非必需基因，即杆状病毒具有可导入性。另外，引入了可在哺乳动物细胞转录的启动子（如巨细胞病毒的IEl启动子）的杆状病毒可以在哺乳动物细胞中持续性表达。Nasimuzzaman， M.及其同事研究出了一种简单的生产及纯化杆状病毒的方法，可扩大其规模，生产出用于基因治疗应用的临床级载体^[14]。癌症基因治疗突破了传统疗法转移方面的局限，加强了载体的特异性，尽量减少副作用，是一种有效、安全的治疗方式。

4.2杆状病毒在癌症基因治疗中的应用的劣势

在注射组织内，杆状病毒不会进行扩散。Heikura等通过实验发现在缺血性兔的骨骼肌模式中，杆状病毒来表达?-galactosidase and VEGF-DΔNΔC时，转导细胞只在针道附近存在^[15]。杆状病毒传递的基因在哺乳动物细胞中的表达时间短。选择合适的启动子， 采取多次感染，不断的补充新的基因可以解决。杆状病毒还可能会被补体或免疫系统迅速灭活。就目前而言，避免被灭活的方法有：使用具有抑制补体系统的动物模型;注入前应用补体激活因子^[15];病毒包膜上表达补体干扰因子^[16];在免疫特权点进行基因传递（如眼睛、大脑、 睾丸或中枢神经系统。 ）^[17];使用BmNPV，在体内和细胞培养中BmNPV对补体失活的抵抗力更强^[18];体外基因传递，从体内分离出合适细胞，进行杆状病毒转导，质量控制后，移植回机体。

肿瘤的基因治疗仍处于探索阶段，且对癌症分子机制有许多不了解。目前，杆状病毒的基因治疗在治疗胃癌方面刚刚起步，在临床动物研究中没有在癌症治疗中的实际应用。

5 前景与展望

如今在癌症的基因治疗中，研究者在其抑制癌细胞再转移方面克服了传统疗法的局限性，基因治疗能通过最大限度地加强病毒载体对肿瘤细胞的特异性，以及尽可能地减少对正常细胞的副作用，将达到比传统疗法更有效的治疗效果。杆状病毒作为一种非复制型基因治疗载体，具有良好的开发和应用前景。随着对其靶向性、调控性、安全性的深入研究和进一步解决其引起的体内补体反应及不断提高其转导和表达效率，杆状病毒必将广泛的应用于哺乳动物的基因治疗。

参考文献

[1]      黄金枝， et al.2003昆虫杆状病毒表达系统研究进展及其应用展望. 蚕业科学.

[2]      习欠云， et al.2009Bac-to-Bac系统在杆状病毒功能基因研究上的应用. 生物技术通报.

[3]      纪小龙， 王辅林. 1994. 癌症的基因治疗现状. 实用癌症杂志.137-139.

[3]      O'Connor T， Crystal R. 2006. Genetic medicines： treatment strategies for hereditary disorders. Nat Rev Genet.7：261-276.

[4]      曹蕾. 1999. 癌症导向基因治疗新进展. 自然杂志.21：33-36.

[5]      王建章， 王士礼， and 蔡昌枰2013杆状病毒在基因治疗中的应用进展. 国际病毒学杂志 20（1）：41-43.

[6]      Huang， W.， X.-L. Tian， Y.-L. Wu， J. Zhong， L.-F. Yu， S.-P. Hu and B. Li （2008）. "Suppression of gastric cancer growth by baculovirus vectormediated transfer of normal epithelial cell specific-1 gene

[7]      王樂遥2008杆状病毒载体抑制Epstein-Barr病毒相关肿瘤的实验研究，复旦大学.

[8]      Wang， C.， F. Li， Y. Yang， H. Guo， C. Wu and S. Wang （2006）. "Recombinant baculovirus containing the diphtheria toxin A gene for malignant glioma therapy." Cancer Res. 66（11）： 5798-5806.

[9]      Guo， H.， Y. Choudhury， J. Yang， C. Chen， F. Tay， T. Lim and S. Wang （2011）. "Antiglioma effects of combined use of a baculovirual vector expressing wild-type p53 and sodium butyrate." J Gene Med 13（1）： 26-36.

[10]    Suzuki T，Chang MO，Kitajima M，et a1.Baeulovirus activates murine dendritic cells and induces non·specific NK cell and T cell immune responses.Cell Immunol，2010，262（1）：35—43.

[11]    Yin， H.-Y. （2010）. "Baculovirus vector-mediated transfer of NIS gene into colon tumor cells for radionuclide therapy." World Journal of Gastroenterology 16（42）： 5367.

[12]    劉小云， etal.      2007      杆状病毒作为基因治疗载体的研究进展.国际病毒学杂志.

[13]    Hüser， A， and C Hofmann2003             Baculovirus vectors： novel mammalian cell gene-delivery vehicles and their applications. Am J Pharmacogenomics 3（1）：53-63.

[14]    Nasimuzzaman， Md， Johannes C. M. Au - van der Loo and Punam Au - Malik. "Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application."JoVE， no. 134 （2018）： e57019.

[15]    Mansouri， M.， and P. Berger2018            Baculovirus for gene delivery to mammalian cells： Past， present and future. Plasmid 98：1-7.

[16]    Sarkis， C.， et al.  2000      Efficient transduction of neural cells in vitro and in vivo by a baculovirus-derived vector. Proc Natl Acad Sci USA 97（26）：14638-43.

[17]    Makkonen， Kaisa-Emilia， Kari Airenne， and Seppo Yl?-Herttulala 2015Baculovirus- mediated Gene Delivery and RNAi Applications.Viruses 7（4）：2099-2125.

[18]    Liu， X， et al.Gene delivery and gene expression in vertebrate using baculovirus nucleopolyhedrovirus vector.