补体C3a、类胰蛋白酶与羊水栓塞关系的研究＊

李 伟，余 舰，龙艳丽，赵 敏，张国栋

（1.湖北省咸宁市第一人民医院病理科 437000；2.贵州省遵义医学院附属医院法医鉴定中心 563003；3.贵州省遵义医学院法医系 563003；4.广西桂林医学院公共卫生学院 541000）

羊水栓塞（amniotic fluid embolism，AFE）是产科发生率低却凶险的并发症之一，严重威胁母婴安全［1］，且AFE的病死率并未随着医疗的进步而有所降低［2］。羊水及其有形成分进入母体循环后如何导致机体出现一系列病理生理变化，迄今为止依然不十分清楚。Benson等［3］认为其发病机制可能是无抗体参加的过敏样反应，羊水进入母体后激发内源性介质的释放，建议将AFE称之为“妊娠过敏样综合征”，与此相关的介质有补体C3a、类胰蛋白酶等［4］。本课题以28例尸检病例为研究对象，采用免疫组织化学法来检测补体C3a、类胰蛋白酶等在肺组织中的表达，从免疫介导的过敏角度初步研究与探讨AFE可能的发病机制，试图为AFE的诊断提供一条新途径。

1 材料与方法

1.1 材料 本研究的标本均来自遵义医学院附属医院病理科及遵义医院。选取近10年产科尸检病例28例，临床高度怀疑尸检明确诊断为AFE病例4例（AFF组）；临床诊断为产后出血而尸检及苏木素－伊红（HE）染色未发现羊水有形成分的病例16例，包括HE染色高度可疑AFE病例（PHH组）；其他8例（阴性对照组）死因分别为：妊娠期高血压疾病、麻醉意外、晚孕疤痕子宫破裂、妊娠期外伤等。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学试剂 补体C3a（北京博奥森公司），TPS（美国DAKO公司），荧光显色剂，二氨基联苯胺（DAB）显色剂，磷酸盐缓冲液（PBS），山羊血清封闭液（北京中衫金桥公司）。

1.2.2 方法及结果判定 所有标本均以10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋。连续石蜡切片，厚约4μm。取肺组织切片进行常规HE染色，免疫组织化学标记及荧光标记。标记抗原为补体C3a、TPS。免疫组织化学采用Envision法，DAB显色。组织抗原修复采用高压与微波修复处理。补体C3a稀释浓度为1∶50，TPS稀释浓度为1∶100。结果判定以肺小动脉或者肺毛细血管内或血管周围出现棕黄色颗粒为阳性结果。棕黄色颗粒少或颜色淡为弱阳性。

1.3 统计学处理 所得数据采用SPSS13.0统计软件进行处理，运用四表格法的确切概率（FISH法）计算，以P＜0.05差异有统计学意义。

2 结 果

尸检明确诊断为AFE的4例病例（AFE组），其HE染色的肺组织切片中，小血管以及毛细血管内看到成团或丝状的鳞状上皮（图1）。

AFE组TPS阳性表达4例，阳性表达为棕黄色颗粒呈光环围绕肥大细胞周围，见图2，阴性对照组肺组织和AFE组中补体C3a表达情况见图3、4，TPS荧光阳性表达则在肺组织毛细血管内可见绿色荧光斑，见图5；PHH组TPS阳性表达9例；阴性对照组TPS弱阳性表达1例；AFE组、PHH组与阴性对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 AFE病例肺小动脉内羊水有形成分（HE×40）

图2 肺组织中肥大细胞脱颗粒TPS表达情况（免疫组织化学×400）

图3 阴性对照组肺组织中补体C3a表达情况（免疫组织化学×100）

图4 AFE组补体C3a情况（免疫组织化学×100）

AFE组补体C3a表达较对照组均降低，阴性对照组中补体C3a表达情况，可见多量棕黄色颗粒，呈阳性表达（图3）；图4AFE组中补体C3a情况，与图3比较棕黄色颗粒明显减少，呈弱阳性表达；PHH组部分补体C3a表达较对照组亦降低，弱阳性表达7例；阴性对照组补体C3a8例均阳性表达；AFE组、PHH组与阴性对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

图5 肺泡壁毛细血管TPS荧光表达（免疫荧光×200）

3 讨 论

AFE虽发生率低但母婴死亡率高，易引起医疗纠纷需要法医学鉴定［5］。目前尚无统一、明确的诊断标准，因此不少患者可能被误诊，一些轻症及不典型患者会因一过性表现而漏诊，贻误最佳治疗时机。

传统诊断无法解释补体活化及类胰蛋白酶释放现象［6］，近年研究发现AFE在血流动力学及血液学上与过敏性休克极为相似［7］。多数学者在研究AFE病例时，仅仅评估其类胰蛋白酶水平，从肥大细胞脱颗粒角度探讨其与过敏反应的关系，并没有同时检测补体水平变化［8］。值得一提的是，在补体参与经典的抗原抗体介导的过敏反应中，可引起肥大细胞脱颗粒反应［9］。补体活化可直接、间接导致机体自身组织损伤，可能是肺循环功能障碍的主要原因，故补体活化可能是AFE的始动环节［8］。本研究中AFE组补体C3a表达与阴性对照组比较，大幅度的降低，而阴性对照组的病例之间的补体水平表达没有明显改变，说明了在AFE过程中可能存在补体活化；产后出血病例中，7例补体C3a表达呈弱阳性，说明此部分的产后出血病例中，可能也存在补体活化。目前关于补体在AFE中作用机制的研究尚少，本课题的回顾性研究对补体C3a与AFE的关系不能做最终定论。其在AFE中的确切分子生物学机制仍待进一步的实验研究。

本研究还发现，AFE病例HE染色均能观察到羊水有形成分，在支气管壁、肺泡毛细血管检测到类胰蛋白酶，呈卫星现象包绕肥大细胞，免疫荧光阳性［10］，表明肥大细胞发生脱颗粒反应，提示在AFE的过程中可能存在过敏反应。本研究16例产后出血（包括2例疑似AFE），类胰蛋白酶阳性表达9例，表明此部分产后出血也可能存在过敏反应。国外报道，超过50%的AFE尸检病例，并无AFE典型临床表现［11］，仅为大量产后出血［12］。本研究中的9例产后出血是否与AFE有直接关系，尚不能确定，还有待更进一步的研究。

对AFE患者或是可疑AFE患者可尝试同时检测补体C3a、类胰蛋白酶的含量，为临床早期治疗、预防严重并发症、缓解紧张的医患关系及为法医学鉴定诊断提供一个较准确的依据，也为AFE的进一步研究奠定基础。

［1］孙富琴.羊水栓塞诊治进展［J］.现代中西医结合杂志，2008，17（26）：4201－4203.

［2］Abenhaim HA，Azoulay L，Kramer MS，et al.Incidence and risk factors of amniotic fluid embolisms：apopulationbased study on 3million births in the United States［J］.Am J Obstet Gynecol，2008，199（1）：e1－8.

［3］Benson MD.A hypothesis regarding complement activation and amniotic fluid embolism［J］.Med Hypotheses，2007，68（5）：1019－1025.

［4］Liao WC，Jaw FS.A noninvasive evaluation analysis of amniotic fluid embolism and disseminated intravascular coagulopathy［J］.J Matern Fetal Neonatal Med，2011，24（11）：1411－1415.

［5］Stolk KH，Zwart JJ，Schutte J，et al.Severe maternal morbidity and mortality from amniotic fluid embolism in the Netherlands［J］.Acta Obstet Gynecol Scand，2012，91（8）：991－995.

［6］侯志刚，宋子亨，赵敏，等.羊水栓塞孕鼠血清类胰蛋白酶的变化及意义［J］.遵义医学院学报，2011，34（4）：407－408，412.

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［8］Fineschi V，Riezzo I，Cantatore S，et al.Complement C3a expression and tryptase degranulation as promising histopathological tests for diagnosing fatal amniotic fluid embolism［J］.Virchows Arch，2009，454（3）：283－290.

［9］Bénard M，Raoult E，Vaudry D，et al.Role of complement anaphylatoxin receptors（C3aR，C5aR）in the development of the rat cerebellum［J］.Mol Immunol，2008，45（14）：3767－3774.

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［11］Stafford I，Sheffield J.Amniotic fluid embolism［J］.Obstet Gynecol Clin N Am，2007，34：545－553.

［12］赵敏，余舰，张国栋.产后出血与羊水栓塞关系的初步研究［J］.中国妇幼保健，2011，26（3）：356－357.