藏系绵羊源沙门菌和产志贺毒素大肠埃希菌的分离与PCR鉴定

张 冰，张焕容，2＊，汤 承，2，王 永

（1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都610041；2.动物医学四川省高等学校重点实验室，四川成都610041）

藏系绵羊（Tibetan sheep）是我国三大原始绵羊品种之一，是高原地区分布最广、数量最多的畜种之一，长期繁衍生息在青藏高原及其毗邻的四川、云南、甘肃的高寒牧区，一般生活在海拔3 000m以上，是长期自然和人工培育选择下形成的一个地方品种［1］。也是藏民族主要的生产资料和生活来源之一。

绵羊的沙门菌病（Salmonellosis）主要由鼠伤寒沙门菌（Salmonella typhimurium）、羊流产沙门菌（Salmonella abortusovis）和都柏林沙门菌（Salmonella dublin）等引起的，并且沙门菌的许多血清型可使人感染，发生食物中毒和败血症等，是重要的人畜共患病［2］。绵羊的沙门菌感染，不分年龄、性别和品种。以断奶或断奶不久的羊较新生羔羊更易感。成年羊中，年轻羊比老龄羊更容易感染，临床上以血性下痢和怀孕母羊流产为特征。羊群暴发一次，一般持续时间为10d～15d，流产率和病死率可达60%［3］。另外，随着分子生物学研究的深入，人们对细菌的毒素、侵袭素与毒力岛等毒力因子的认识也在不断的深入，沙门菌的侵袭蛋白（invasion protein，inv）是由invA、invB、invC、invD和invE等一组基因编码，其中invA为沙门菌的主要毒力因子，高度保守，几乎存在于所有血清型沙门菌中，其编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白，决定沙门菌对肠黏膜细胞的侵袭力，与其致病性密切相关［4］。

普通的大肠埃希菌并不导致动物患病，但有些大肠埃希菌在漫长的进化过程中由于某种原因获得了毒力基因，因此具备了致病能力。致病性大肠埃希菌引起的大肠杆菌病是一类多种动物共患的传染病，尤其是幼龄动物多发。因致病性大肠埃希菌的血清型不同，表现的病理过程和临床症状也不一致。一般以肠炎多见，有时还可引起败血症和毒血症，引起动物死亡，或者严重影响幼畜生长发育，并且大肠杆菌病多与其他疾病并发，给畜牧业发展造成重大损失［5］。产志贺毒素大肠埃希菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli，STEC）就是其中一种能引起人畜共患病的细菌，可以引起一系列的人类疾病，包括水样腹泻（watery diarrhea）、出血性肠炎（hemorrhagic colitis，HC）、血小板减少性紫癜（thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP）、溶血性尿毒综合征（hemolytic uremic syndrome，HUS）。由STEC引起的消化道疾病在世界各地都有暴发，这一类病原菌已成为威胁人类健康的重要致病菌［6-9］。STEC能够产生类志贺毒素（Shiga-like toxins，Stx），包括Stx1和Stx2两种类型，Stx1的基因序列相对保守，目前已报道的有Stx1c（Slt1ox3／Stx1ox3）、Stx1d、Stx1v51／Stx1v52 等［10］。Stx2 基因具有多种亚型包括Stx2c（Stx2vha，Stx2vhb，Stx2vhd）、Stx2d（Stx2d-ount，Stx2d-ox3a，Stx2do111）、Stx2e、Stx2f至少10余种，因Stx基因具有不同的亚型，它们能够结合的受体也不同，因此它们感染的对象和致病特征也各不相同［11-12］。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 采自四川省红原县外观健康的藏系绵羊肛门拭子19份，低温运送至实验室。

1.1.2 主要试剂 缓冲蛋白胨水（BPW）、TTB增菌液、SS琼脂培养基、伊红美蓝培养基、麦康凯培养基和XLD培养基，购自杭州微生物试剂有限公司；DNA Marker DL 2 000购自Tiangen公司；EX-TaqDNA聚合酶、dNTP、pMD19-T vector试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；AXY prepTM DNA胶回收试剂盒购自Axygen公司，其他试剂为国产分析纯试剂。

1.1.3 阳性菌株 产志贺毒素大肠埃希菌阳性菌株O157和沙门菌阳性菌株由西南民族大学生命科学与技术学院动物医学实验室保存。

1.2 沙门菌的分离鉴定

1.2.1 预增菌 低温保存运送至实验室的19份藏系绵羊肛门拭子分别置于10mL BPW增菌液中于36℃±1℃培养8h～18h。

1.2.2 增菌 取1mL预增菌液转接于10mL TTB增菌液内，于42℃±1℃培养18h～24h。

1.2.3 分离培养 用接种环取增菌液，分别划线接种于SS琼脂平板和XLD平板，于36℃±1℃培养18h～24h，观察各平板上生长的菌落，挑取SS平板上灰白色、半透明、圆珠状、边缘整齐、光滑湿润、中心黑色，中等大小的菌落3个～5个或透明，针尖大小的菌落和XLD平板上呈粉红色，带或不带黑色中心的菌落3个～5个，革兰染色，镜检。然后将典型菌落分别划线接种于麦康凯平板于36℃±1℃培养18h～24h，观察平板上生长的菌落，挑取3个～5个细小无色典型菌落，划线接种于SS琼脂平板36℃±1℃培养24h进一步纯化。

1.2.4 大肠埃希菌的分离鉴定 在上述1.2.3的SS琼脂平板上钓取红色菌落和XLD平板上钓取黄色菌落各3个～5个，经革兰染色，镜检。然后将典型菌落分别划线接种于麦康凯平板于36℃±1℃培养18h～24h，观察平板上生长的菌落，挑取麦康凯平板上红色典型菌落接种到伊红美蓝培养基上于36℃±1℃培养18h～24h，观察平板上生长的菌落，培养后取紫黑色并带金属光泽的典型菌落划线接种于麦康凯琼脂平板上，36℃±1℃培养24h进一步纯化。

1.2.5 沙门菌和产志贺毒素大肠埃希菌的PCR鉴定

1.2.5.1 沙门菌的PCR鉴定 根据GenBank中已发表的沙门菌invA基因的保守基因序列和国内外参照文献［13］合成引物如下：invA-1：5′-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3′，invA-2：5′-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3′，预期扩增片段长度为284bp，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。挑取纯化好的单个沙门菌菌落接种到LB液体培养基中37℃ 过夜培养后作为模板。反应体系为10×PCR buffer 2.0μL，10 mmol／L dNTPs 2.5μL，Taq酶0.5μL，模板量为1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，灭菌ddH2O 17μL，总体积25μL，然后进行PCR反应。PCR循环参数为：94℃预变性5min；94℃45s；60℃45s；72℃1min，依次进行30个循环；72℃10min。用20 g／L琼脂糖凝胶电泳分析，胶回收PCR产物、克隆并测序。

1.2.5.2 产志贺毒素大肠埃希菌双重PCR鉴定根据国内外参考文献合成产志贺毒素大肠埃希菌Stx1和Stx2的引物（表1），引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 产志贺毒素大肠埃希菌的引物信息Table 1 Primer information of Shiga toxin-producing Escherichia coli

纯化好的产志贺毒素大肠埃希菌经LB液体培养基过夜培养后作为模板。25μL双重PCR反应体系为：TaqDNA聚合酶（5U／μL）0.15μL，MgCl22.5μL（250mmol／L），10×PCR buffer 2.5μL，dNTP 2.5μL （2.5mmol／L），STX1上、下游引物（10μmol／L）各 0.6μL，STX2 上、下游引物 （10 μmol／L）各0.7μL、菌液模板2μL，ddH2O补足25 μL。PCR循环参数：94℃ 预变性5min；94℃30 s；58℃40s；72℃1min，依次进行35个循环；72℃10min。用20g／L琼脂糖凝胶电泳分析，胶回收PCR产物、克隆并测序。

1.2.6 基因序列同源性分析 由上海生工生物工程技术服务有限责任公司测序，将测序结果进行同源性分析并运用MEGA5.05生物软件构建系统进化树。

2 结果

2.1 沙门菌的分离与PCR鉴定结果

从19份藏系绵羊粪便拭子中分离出沙门菌1株，革兰染色符合相应菌属的特征。PCR扩增出约300bp的特异性条带（图1）。

2.2 大肠埃希菌的分离与PCR鉴定结果

共分离出13株大肠埃希菌，经产志贺毒素大肠埃希菌PCR鉴定，其中有4株能扩增出目的条带，这4株中3株只检测出了Stx1基因片段，1株只检测出了Stx2基因片段（图2）。

图1 沙门菌分离株的PCR检测结果Fig.1 PCR amplification of invA gene of isolated Salmonella

图2 产志贺毒素大肠埃希菌的PCR检测结果Fig.2 PCR amplification of stx1and stx2genes from isolated Escherichia coli strains

2.3 基因同源性分析结果

应用NCBI上的BLAST和DNAMAN软件分析沙门菌分离株invA基因片段与GenBank上登录的沙门菌的invA基因同源性高达99.8%，4株产志贺毒素大肠埃希菌分离株与GenBank上登录的产志贺毒素大肠埃希菌的stx1和stx2基因同源性都大于95%。

由图3可知，沙门菌分离株S19invA基因片段与豪顿沙门菌（S.entericasubsp.houtenae）、萨拉姆沙门菌（S.entericasubsp.salamae）、甲型副伤寒沙门菌（S.paratyphi）、鸡白痢沙门菌（S.pul-lorum）、鸡沙门菌（S.gallinarum）和森夫顿堡沙门菌（S.senftenberg）所含有的invA基因片段在进化树同一枝上，表明S19是沙门菌，但其血清型有待进一步鉴定，同时也说明了invA基因具有较高的保守性，可以作为多种血清型沙门菌检测的首选基因。

由图4进化树可以看出，产志贺毒素大肠埃希菌分离株（S6、S8、S11）具有相同的产志贺毒素基因stx1A和stx1B，S3株只含有stx2A和Sstx2B基因，与其他3株（S6、S8、S11）分离株产志贺毒素基因stx1同源性较低。

图3 沙门菌分离株S19与NCBI上登录的主要沙门菌菌株invA基因核苷酸序列进化树Fig.3 Phylogenetic tree of Salmonella S19isolates based on partical invA gene sequences in NCBI database

图4 产志贺毒素大肠埃希菌分离株与NCBI上登录的主要产志贺毒素大肠埃希菌菌株stx1和stx2基因核苷酸序列进化树Fig.4 Phylogenetic tree of Shiga toxin-producing Escherichia coli isolatas based on partical stx1and stx2gene sequences in NCBI database