鸡干扰素调节因子7的原核表达及多克隆抗体的制备

崔鹏飞，邓国华，韦良孟，焦培荣＊，廖 明＊

（1.华南农业大学兽医学院，广东广州510642；2.人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室

农业部兽用疫苗创制重点实验室 广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室，广东广州510642；3.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江哈尔滨150001）

干扰素调节因子7（interferon regulatory factor 7，IRF7）是干扰素调节因子家族的成员之一，在Ⅰ型干扰素的诱导表达过程中发挥着重要作用。最初IRF7因结合EB病毒编码基因EBNA-1的Qq启动子区域而被发现［1］。IRF7在大多数细胞中呈低水平表达，但当细胞受到病毒感染、脂多糖、干扰素、某些化学物质如丁酸钠刺激后，细胞内的IRF7表达水平会迅速升高，进而诱导Ⅰ型干扰素的表达［2］。IRF7除了参与调节干扰素介导的先天性免疫反应外，还参与调节细胞生长和凋亡、调节免疫细胞的分化和激活等过程［3-5］。目前，有关IRF7的研究主要集中在哺乳动物，而对于禽类IRF7的研究相对较少，本研究旨在通过原核表达系统表达鸡干扰素调节因子7（chIRF7）蛋白，并以其为免疫原制备鼠抗鸡干扰素调节因子7（chIRF7）蛋白多克隆抗体，为进一步研究家禽免疫调节过程中chIRF7的生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒、菌株及实验动物 原核表达载体pET30a，感受态细胞JM109、BL21（DE3）均由本实验室保存，9日龄～11日龄SPF鸡胚与6周龄～8周龄Balb／c雌性小鼠购自广东省实验动物中心。

1.1.2 主要试剂 Phusion高保真DNA聚合酶，限制性内切酶EcoRⅠ、NotⅠ均购自NEB公司；Ligation High高效连接试剂盒购自Toyobo公司；RNA提取试剂盒购自Qiagen公司；质粒小提和胶回收试剂盒购自OMEGA公司；His·Bind Resin购自Novagen公司；M-MLV逆转录酶购自Promega公司；IPTG和DNA Marker购自宝生物工程（大连）有限公司；Protein Marker购自Fermentas公司；弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自Sigma公司；FITC标记的羊抗鼠二抗购自Southernbiotech公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据GenBank中登录的chIRF7的mRNA序列（登录号为205372.1），通过Primer Premier 5.0软件设计一对扩增chIRF7开放阅读框全长的特异性引物，引物序列如下：

chIRF7UP：5′-CCGGAATTCGCA GCACTGGACAGCGAG-3′（下划线处为EcoRⅠ酶切位点），

chIRF7Low：5′-ATAGTTTAGCGGCCGCTC-AGTCTGTCTGCATGTG-3′（下划线处为NotⅠ酶切位点）。

1.2.2 鸡胚成纤维细胞（CEF）总RNA的提取 以禽流感病毒感染CEF细胞，感染12h后收集CEF细胞，按照Qiagen公司RNA提取试剂盒说明，提取CEF细胞总RNA。

1.2.3 chIRF7的RT-PCR扩增 以提取的CEF细胞总RNA为模板，参照Promega公司的M-MLV逆转录酶说明书进行反转录合成cDNA。以反转制备的cDNA为模板，利用高保真Phusion DNA聚合酶，扩增chIRF7ORF全长，反应程序如下：98℃30 s；98℃10s，63℃30s，72℃50s，35个循环；72℃10min。

1.2.4 PET30a-chIRF7重组质粒的构建与鉴定将chIRF7的PCR纯化产物与原核表达载体PET30a分别用EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切，然后连接、转化至JM109感受态细胞，挑取卡那霉素抗性平板中单菌落过夜培养，提取质粒，通过PCR、酶切、测序筛选阳性重组质粒。

1.2.5 chIRF7蛋白的诱导表达与纯化 将测序正确的重组质粒PET30a-chIRF7转化至大肠埃希菌BL21（DE3），挑取单菌落，过夜培养后，以1∶100比例接种至新鲜卡那霉素抗性的液体LB中，待菌液OD 600达到0.6～1.0时，加入终浓度为0.2 mmol／L的IPTG，于37℃诱导表达4h，取菌液与2×SDS Loading buffer等体积混合，沸水煮5min后置于冰上冷却，通过SDS-PAGE检测重组蛋白的表达情况。对IPTG诱导浓度、诱导温度进行优化后，大量诱导表达重组蛋白，并利用Novagen公司的His·Bind Resin纯化重组蛋白。

1.2.6 鼠抗chIRF7蛋白多克隆抗体的制备 取纯化好的chIRF7蛋白与等体积弗氏完全佐剂乳化均匀后免疫接种6周龄～8周龄Balb／c小鼠，首免后每隔2周用chIRF7蛋白与等体积弗氏不完全佐剂乳化均匀后加强免疫接种两次，三免后10d，断尾采血通过间接ELISA测定血清抗体效价。

1.2.7 间接免疫荧光技术（IFA）检测chIRF7蛋白多抗的反应性 以禽流感病毒感染CEF细胞，分别于感染后0、4、8、12h，取细胞用40g／L多聚甲醛室温固定15min，5mL／L Triton X-100通透10min，然后将小鼠抗chIRF7蛋白多抗血清1∶500稀释作为一抗，37℃孵育1h，PBST洗涤3次后，加入1∶1 000稀释的FITC标记羊抗鼠二抗，37℃孵育1h，PBST洗涤3次后用荧光显微镜进行观察。

2 结果

2.1 chIRF7基因的扩增与克隆

以禽流感病毒（AIV）感染CEF细胞的总RNA为模板，利用RT-PCR技术，扩增出大小约为1 500 bp的chIRF7-ORF基因（图1），将PCR产物和原核表达载体PET30a分别用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后连接、转化至JM109感受态细胞，将菌液PCR检测疑似阳性重组质粒样品用EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切验证，结果可切出大小约为1 500bp的目的片段和5 400bp左右的载体片段（图2），与预期大小相符。测序结果显示，插入目的片段序列与Gen-Bank中公布的原始序列同源性为100%，表明重组质粒构建成功，将其命名为PET30a-chIRF7。

图1 chIRF7-ORF的PCR扩增Fig.1 Amplification of chIRF7ORF gene by PCR

图2 重组质粒PET30a-chIRF7的酶切及PCR鉴定Fig.2 Identification of PET30a-chIRF7by enzyme digestions and PCR

2.2 chIRF7重组蛋白的诱导表达与纯化

将重组质粒PET30a-chIRF7转化至大肠埃希菌BL21（DE3），经IPTG诱导，SDS-PAGE检测结果显示，IPTG诱导后在60ku处有蛋白表达，与预期融合蛋白大小一致。而转化PET30a空载体的对照组，在此处无蛋白表达。对诱导条件优化结果显示，IPTG浓度对于目的蛋白的表达量影响不大，在25℃条件下进行诱导，目的蛋白能够大量可溶性表达。利用Novagen公司的His·Bind Resin对目的蛋白进行纯化，取纯化蛋白进行SDS-PAGE检测，结果在60ku处可见清晰的蛋白条带（图3）。

图3 SDS-PAGE分析纯化的重组chIRF7蛋白Fig.3 SDS-PAGE analysis of purified rchIRF7proteins

2.3 鼠抗chIRF7蛋白多克隆抗体效价测定

以纯化好的重组蛋白rchIRF7免疫6周龄～8周龄Balb／c小鼠，三免后10d断尾采集小鼠血液，分离血清，用间接ELISA测定血清抗体效价在1∶51 200以上。

2.4 IFA检测chIRF7蛋白多抗的反应性

通过IFA检测鼠抗chIRF7蛋白多抗血清与AIV感染CEF细胞内chIRF7蛋白的反应情况，结果未受禽流感病毒感染刺激的CEF细胞检测不到荧光，而禽流感病毒感染CEF细胞后4、8、12h均可检测到特异性荧光，并且产生荧光细胞的数目和荧光强度随着感染时间的延长而增加（图4）。

3 讨论

IRF3和IRF7具有高度的同源性，是干扰素调节因子家族中参与Ⅰ型干扰素表达调控的主要成员。IRF3在机体中呈组成性表达，以非活化的单体形式存在于细胞质中。与IRF3不同，IRF7在大多数细胞中的表达量很低，但它可以被Ⅰ型干扰素介导的信号通路激活并大量表达。在病原微生物入侵后，IRF3首先被活化，活化的IRF3移位至细胞核，与NF-kB和AP-1等转录因子协同作用，诱导早期IFN-β和IFN-α4的表达。这些快速而低水平表达的干扰素，可通过干扰素信号通路的正反馈调节诱导IRF7蛋白的大量表达［6］。因此，在通过IFA检测chIRF7蛋白多抗反应性时，未感染AIV的CEF细胞由于体内IRF7蛋白含量太低而检测不到荧光，而在AIV感染的刺激下CEF细胞内IRF7蛋白的表达量增加，所以AIV感染的CEF细胞可检测到荧光，并且荧光强度和产生荧光的细胞数目随着感染时间的增加而增加。

图4 IFA检测chIRF7蛋白多抗的反应性Fig.4 Identification the reactivity of chIRF7protein with polyclonal antibody by IFA

本研究在大肠埃希菌中成功地表达了chIRF7蛋白，将纯化的重组蛋白rchIRF7免疫小鼠，可诱导产生高滴度的多克隆抗体，间接ELISA测定抗体滴度在1∶51 200以上，该多克隆抗体可以识别AIV感染的CEF细胞内的chIRF7蛋白，表明制备的多克隆抗体具有良好的特异性，为进一步研究chIRF7的生物学功能奠定了物质基础。

［1］ Zhang L，Pagano J S.IRF-7，a new interferon regulatory factor associated with Epstein-Barr virus latency［J］.Mol Cell Biol，1997，17（10）：5748-5757.

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［5］ Savitsky D，Tamura T，Yanai H，et al.Regulation of immunity and oncogenesis by the IRF transcription factor family［J］.Cancer Immunol Immunother，2010，59（4）：489-510.

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