HPLC 法测定苹果树腐烂病菌发酵液中的有机酸和葡萄糖*

简利茹，王海瑛，韩青梅

1(旱区作物逆境生物学国家重点实验室(西北农林科技大学)，陕西 杨凌，712100)2(西北农林科技大学植保学院，陕西 杨凌，712100)

苹果树腐烂病是由苹果黑腐皮壳菌(Valsa mali Mayabe et Yamada)引起的一种苹果树枝干病害［1-2］，在我国各苹果产区普遍发生，可以使苹果树主枝、主干枯死，给苹果产业造成严重的经济损失［3-5］。王建华等［6］报道，苹果树腐烂病菌发酵液中有机酸对根皮苷的降解有很大影响，所以研究发酵过程中有机酸的生成量及葡萄糖的消耗速率，对于确定菌体内的代谢通量分布及发酵过程的优化控制都具有重要意义。

近年来，有机酸和葡萄糖的检测方法多用高效液相色谱法(HPLC)，如胡志群等［7］用高效液相色谱测定荔枝果肉的酸和糖是用不同的柱子分开检测，此法分析时间长，流动相损耗大，易污染。姜岷等［8］利用Aminex HPX-87H 离子排斥色谱柱测定纤维素水解液厌氧发酵产丁二酸发酵液中有机酸和混合单糖，由于氢离子交换柱较贵，一般实验室不具备此柱子。白冬梅等［9］利用Eclipse XDB-C8柱同时检测琥珀酸发酵液中的有机酸和葡萄糖，图谱分离效果不好，拖尾严重。因此，对苹果树腐烂病菌等微生物发酵液这种培养基组分复杂而待测物含量较低的样品，一种高灵敏度快速测定的方法显得尤为重要。本研究应用C18柱，采用HPLC 法串联两种检测器进行检测，建立了一种能够快速准确测定苹果树腐烂病菌发酵液中有机酸和葡萄糖的方法。

1 材料和方法

1.1 试剂和仪器

试剂:苹果酸(色谱纯)、乳酸(色谱纯)、柠檬酸(色谱纯)、富马酸(色谱纯)、琥珀酸(色谱纯)及葡萄糖(色谱纯)均购自SIGMA 公司。甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯，实验用水为Milli-Q 二次超纯水。苹果树腐烂病菌由西北农林科技大学植物病害综合防治实验室提供。

仪器:Waters 600 型高效液相色谱仪，美国Waters 公司;PB-10 型酸度计，德国Sartorius 公司;Mill-Q水处理系统，MILLPORE 美国公司。

1.2 培养基

培养液成分(g/L):葡萄糖10，L-天门冬酰胺2，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.5，ZnSO4·7H2O 0.88，Fe(NO3)3·H2O 0.0015，MnSO4·5H2O 0.000 44，去离子水1L。

1.3 发酵液的制备

在200 mL 灭菌液体培养基中，加入7 块直径7 mm 的苹果树腐烂病菌菌饼，25℃下静置培养，每天振摇2 次。定期取1 mL 发酵液于10 000 r/min 转速下离心10 min，取上清液经0.22 μm 针式水膜过滤后进样10 μL 进行高效液相检测。

1.4 混合标准溶液的配制

精确称取苹果酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸各100 mg、富马酸2 mg 和葡萄糖6 g，用二次水溶解并定容于100 mL 容量瓶中，配置成标准混合溶液，其中富马酸0.02 mg/mL、葡萄糖60 mg/mL，其他组分1 mg/mL，再用二次水将标准溶液分别稀释2 倍、10 倍、50倍、100 倍、200 倍及1 000 倍。

1.5 色谱条件

采用Waters600 型高效液相色谱仪(美国Waters公司)，以5 g/L NH4H2PO4(用磷酸调pH=2.5)溶液为流动相;分析柱为Atlantis C18色谱柱(150 mm ×4.6 mm，3.5 μm);流速0.6 mL/min;柱温30℃;Waters 2487 紫外检测器，检测波长210 nm;Waters 2414示差检测器，检测器温度40℃;上样量为10 μL。

2 结果与讨论

2.1 HPLC 实验方法的建立

2.1.1 色谱柱的选择

有机酸常采用C18硅胶柱进行分离，因有机酸极性较大，使用的流动相中水的比例较高，一般色谱柱在高水相环境中容易疏水塌陷，因此实验中选用了更耐水相的Waters 公司的Atlantis C18色谱柱。

2.1.2 柱温的选择

设定柱温20℃、30℃、38℃对标准溶液中各组分进行分离。由于温度升高时会增加有机酸的离解，各有机酸分离效果不好;但温度降低组分的响应值减小，保留时间增加，分析时间延长。比较不同温度下的分离曲线图谱，选择最佳分离温度为30℃。

2.1.3 检测器的选择

利用有机酸及葡萄糖对紫外检测器及示差检测器响应信号强弱的差异，同时经过Atlantis C18色谱柱有效的分离，洗脱样品先经紫外检测器检测其中的有机酸，再经示差检测器检测葡萄糖。示差检测器温度设定为恒定40℃。

2.1.4 流动相pH 值的选择

有机酸为弱酸性，在流动相水的比例较大的环境中易被电离。流动相合适的pH 值会改善峰形对称，减少峰拖尾。通过了解有机酸的解离常数［10］，本实验考查了流动相的pH 值在2 ～3 对分离的影响，结果表明，pH 值越小峰型越好，考虑到C18柱对酸的耐受性，本实验最终选用流动相的pH 为2.5。

2.1.5 流动相缓冲盐浓度的选择

分别配成浓度为2 g/L、5 g/L、8 g/L、10 g/L 的NH4H2PO4溶液(用磷酸调pH 为2.5)对标准溶液进行分析以考察缓冲盐浓度对色谱分离的影响。结果表明:当缓冲盐浓度大于5g/L 时，各组分都得到有效分离。由于缓冲盐浓度越大对泵和色谱柱的寿命都会产生影响，所以最终选用5 g/L 的NH4H2PO4作为流动相。

2.2 标准曲线和线性范围的测定

取各系列混合标准溶液10 μL，在最佳色谱条件下上机进行分析，混合标样(富马酸0.4 μg/mL，葡萄糖1.2 mg/mL，其他有机酸20 μg/mL)的紫外(UV)和示差(RI)色谱图如图1。从图1 可以看出，在210 nm 下，除葡萄糖外，其他有机酸都能被很好地分离并被紫外检测器检测出;而示差检测器对富马酸没有响应，虽其他有机酸能够和葡萄糖很好的分离但响应较低。最终确定以紫外检测器分析有机酸，以示差检测器分析葡萄糖，各组份的峰面积y 对浓度x 进行线性回归，得到各物质的线性回归方程。线性范围、相关系数和检出限(信噪比为3)等定量参数见表1 。

图1 混合标准溶液色谱图Fig.1 Chromatogram of standards mixtures

表1 标准曲线的线性参数Table1 The linear parameters of standard curves

2.3 发酵液样品的测定

取苹果树腐烂病菌摇瓶发酵不同时间(0、1、2、4、6 d)的发酵液，在上述分离条件下进行色谱分析，测定其葡萄糖的消耗和产生的有机酸，结果见表2，图2 为发酵2d 的色谱分离图。

表2 不同发酵时间的测定结果Table 2 The determination results of different fermentation time

从图2 可知，苹果树腐烂病菌发酵产物比较复杂，除了产生一些有机酸外，还有其他一些未知物。从表2 可以看出随着发酵时间的延长，有机酸的产量都呈上升趋势，而葡萄糖经过6d 发酵后几乎消耗殆尽。

2.4 方法的回收率和重复性试验

取同一发酵液4 份，其中一份作本底，按上述实验方法重复测定5 次，考察方法精密度;另3 份各添加一定量的标准物质，考察回收率，结果见表3。本方法的回收率为96.2% ～102.2%，精密度为0.26%～0.75%，且不受发酵液中大量杂质的干扰。

图2 苹果树腐烂病菌发酵液色谱图Fig.2 Chromatogram of Valsa mali Var. mali fermentation liquid

表3 回收率和精密度实验结果(n=5)Table 3 Results of recovery and precision (n=5)

3 结论

苹果树腐烂病菌发酵液经过离心处理后，采用反相Atlantis C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，3.5 μm)，以5 g/L NH4H2PO4溶液(pH2.5)为流动相，流速0.6 mL/min，柱温30℃，采用不同的检测器，可同时分析待测样中的有机酸及葡萄糖，每一样品的分析过程不超过15min。此方法快速、高效、准确，可用于在线监测发酵过程中底物的利用情况及产物生成情况，确定菌体内的代谢通量分布，从而对发酵过程的优化控制具有重要的意义。

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