大肠杆菌中芥蓝抗坏血酸过氧化物酶基因的高效表达*

黄加保，唐蕾，华子安，毛忠贵

1(江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡，214122)2 (江南大学 生物工程学院，江苏 无锡，214122)

抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate peroxidase，Apx，EC1. 11. 1.11)，也称维生素C 过氧化物酶，是一种以抗坏血酸(Ascorbic acid，AsA)为电子供体的过氧化物酶。1976 年Foyer 和Halliwell［1］在菠菜叶中发现了一种脱氢抗坏血酸还原酶，1981 年Nakano和Asada［2］将其正式定名为Apx。Apx 主要存在于高等植物、真核藻类及某些蓝细菌中。在高等植物中，已报道4 种不同细胞定位的Apx 同工酶，它们分别为:叶绿体基质Apx(sApx)、类囊体膜Apx(tApx)、微体Apx(mbApx)和胞质Apx(cApx)［3］。Apx 在植物中有特定的生理功能，是清除植物体内H2O2的关键酶之一，同时在植物抗逆性、果蔬采后品质变化等方面也发挥着重要作用。

芥蓝(Brassica alboglabra L. )是十字花科芸薹属草本植物，属甘蓝的一个变种［4］，原产于中国南部，是我国著名的特产蔬菜之一，主要以花薹为产品，在广东、福建等省栽培。芥蓝具有很高的营养价值，含有丰富的维生素、矿物质和芥子油苷等，特别是维生素C 含量很高［5-7］。维生素C 是Apx 的底物，其含量的高低与Apx 的活性密切相关。人们已研究了茶叶［8］、拟南芥［9］、大豆［10］、盐地碱蓬［11］等植物的Apx，但与芥蓝Apx 相关的研究尚未见报道。直接从芥蓝中分离纯化Apx，工序复杂，耗时耗力，且不易实现大规模制备。本研究旨在通过基因工程方法从芥蓝幼苗叶中扩增apx 基因，并将其转入大肠杆菌中表达。重组蛋白经简单的Ni2+柱纯化就能大量制备，为进一步研究Apx 的生理特性和功能打下一定的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒

宿主菌E. coil BL21 由本实验室保藏，表达质粒pET-28a 购于Novagen 公司。

1.1.2 培养基

固体琼脂培养基:2%琼脂，自来水。

LB 液体培养基:酵母提取物5 g /L，胰蛋白胨10 g /L，NaCl 10 g /L，pH 7.0 ～7.4。

LB 固体培养基:LB 液体培养基中加入2%的琼脂。

1.2 方法

1.2.1 总RNA 提取及cDNA 的合成

芥蓝无菌苗的种植 选取籽粒饱满的芥蓝种子(北京南无科贸有限责任公司)先用70%的乙醇浸泡1 min 后无菌水冲洗3 次，再用10% 双氧水浸泡5 min，无菌水冲洗5 次。无菌环境下将种子接到灭菌的固体琼脂培养基中，26℃光照培养箱中培养1 周，光照时间为8 h/d。

总RNA 的提取 采用改进的CTAB-LiCl 沉淀法［12］，从生长1 周的幼苗叶中提取总RNA，利用Reverse Transcriptase M-MLV(大连宝生物工程有限公司)合成cDNA 链。以cDNA 为模板进行RT -PCR及RACE 扩增。

1.2.2 apx 基因扩增

根据GenBank 公布的芸薹属植物过氧化物酶基因序列，以保守序列为参照(引物见表1 apx fra)，得到apx 部分基因，之后按照5’-Full RACE Kit 和3’-Full RACE Core Set Ver.2.0(大连宝生物工程有限公司)中的操作说明，分别进行5’-RACE 和3’-RACE扩增。扩增引物见表1。对扩增产物进行测序，用DNAMAN V6 软件进行序列拼接，最后得到apx 基因全序列。根据基因全序列设计带有限制性酶切位点的引物(见表1 apx ful)，进行RT-PCR 扩增、纯化、构建质粒。

表1 apx 基因扩增引物序列Table 1 Sequences of primers for apx gene amplification

1.2.3 pET-28a-apx 的构建及克隆

将RT-PCR 的纯化产物及载体pET-28a 经BamHⅠ和NotⅠ双酶切后连接，构建重组质粒pET-28aapx。将pET-28a-apx 转化E. coil BL21 感受态细胞，涂布于含100 μg/mL 卡那霉素(kanamycin，kan)的LB 平板上，37℃培养过夜。挑取单菌落接种于含kan (100 μg/mL)的LB 液体培养基中培养，收集细胞，用MiniBEST Plasmid Purification Kit(大连宝生物工程有限公司)提取质粒，双酶切验证。将筛选的阳性重组菌置于甘油管中-20℃保存。

1.2.4 重组蛋白表达鉴定及条件优化

重组蛋白表达鉴定 将阳性重组菌于37℃，200 r/min 培养过夜，以2%的接种量转接至含有kan 的新鲜LB 液体培养基中，相同条件下培养2.5 h 左右，至OD600达到0.6，向培养基中加入终浓度为1 mmol/L 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)，37℃，200 r/min，诱导表达4 h，收获菌体。用20 mmol/L (pH7.5)的Tris-HCl 缓冲液(含有质量分数为0.1%脱氧胆酸钠)悬浮菌体，湿菌体与缓冲液的比例为1∶16 (W/V)。200 w，工作1 s，间歇3 s，超声破碎15 min。10 000 r/min 离心25 min 得到上清液，测定酶活性并进行SDS-PAGE 电泳鉴定。

表达条件优化 采用单因素实验，诱导条件:温度为16、23、30 和37℃，IPTG 的终浓度为0.05、0.1、0.2和0.3 mmol/L (不加IPTG 为对照);诱导时间为0、4、8 、10 和12 h，收获菌体，悬浮，破碎离心，测定上清液酶活力和蛋白浓度，计算比酶活。

1.2.5 酶活力及蛋白浓度的测定

参照沈文飚［13］的方法并加以改进。200 μL 的反应体系:依次加入终浓度为0.5 mmol/L 乙二胺四乙酸，0.5 mmol/L AsA，50 mmol/L 磷酸缓冲液(pH7.0)和适量酶液，最后加入终浓度为0.2 mmol/L H2O2启动反应，室温下测定290 nm 处的吸光值，记录反应30 s 内吸光值的变化(△OD)。以1min 氧化1 μmol AsA 的酶量作为1 个酶活性单位(U)。比酶活= U/蛋白质浓度(U/g)。

蛋白质浓度测定采用BCA 试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司)，以牛血清蛋白为标准蛋白。

1.2.6 重组蛋白纯化及最适酶反应条件测定

重组蛋白纯化采用Akata avant 纯化系统。将23℃，0.2 mmol/L IPTG 诱导培养10 h 的菌液离心沉淀，以结合缓冲液(20 mmol/L 磷酸缓冲液，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑，pH7.4)重悬菌体，湿菌体与缓冲液的比例为1∶16 (W/V)。超声破碎后离心收集上清液，上样至预先平衡的Histrap FF crude柱(GE Healthcare，Life Science)，按照说明书操作方法，纯化重组Apx，纯化后的样品进行SDS-PAGE 鉴定及酶活性测定。

酶的最适反应条件测定将纯化后的酶蛋白在不同温度(20、25、30、35、40、45℃)和不同的pH (3、4、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、9)下测定酶活，将最高酶活计为100%，计算相对酶活。

1.2.7 数据分析

采用SPSS 13.0 软件对数据进行方差分析。

2 结果与讨论

2.1 芥蓝Apx 编码基因的获得

根据GenBank 公布的芸薹属植物过氧化物酶的基因序列，以保守序列为参照，设计引物apx fra，以芥蓝cDNA 为模板RT-PCR 得到400 bp 左右条带(图1A)，将该条带割胶纯化测序，依照测序结果设计apx 3’和5’RACE 引物，分别得到700 bp (图1C)和550 bp (图1B)左右的3’及5’RACE 产物，将产物测序后用DNAMAN V6 软件拼接，得到apx 基因序列全长(GenBank 登录号:KC894750)。

图1 PCR 扩增apx 基因片段电泳图Fig.1 Electrophoresis diagram of apx amplification fragments by PCR

采用DNAMAN V6 软件分析得到芥蓝apx 编码区全长为753 bp，ATG 是起始密码，TAA 为终止密码，共250 氨基酸，分子质量推算约为27.6 kDa。将apx 在NCBI 中BLAST 比对，该基因与芸薹属甘蓝apx 的序列相似度高达99%。初步鉴定该apx 属于芥蓝抗坏血酸过氧化物酶的胞质同工酶基因。

2.2 pET-28a-apx 在E. coil BL21 克隆表达

将apx 编码基因插入表达载体pET-28a，构建的重组质粒pET-28a-apx 转化至E. coil BL21 中，扩增后提取质粒，酶切、琼脂糖凝胶电泳验证，结果表明:重组质粒经BamH I 和Not I 双酶切、电泳后，在6 000 bp 和750 bp 各出现了一条带，分别为质粒和目的基因，说明重组质粒构建成功(图2)。

图2 pET-28a-apx 双酶切鉴定电泳图Fig.2 Electrophoresis diagram of pET-28a-apx digested by two restriction enzymes

分别收集含有pET-28a 及pET-28a-apx 质粒的E. coil BL21 细胞，并将细胞破碎，离心得到上清液，进行SDS-PAGE，结果表明，在含有pET-28a-apx 质粒，并经IPTG 诱导的细胞上清液中，有明显的目的蛋白条带，分子质量为29 kDa (图3)。

图3 Apx 表达及纯化的SDS-PAGE 图谱Fig.3 SDS-PAGE showing Apx expression and purification

2.3 重组蛋白pET-28a-apx 表达条件优化

为了提高重组蛋白的酶活性，本文对影响酶表达水平的关键因子即诱导剂浓度、诱导时间和温度进行了研究。结果表明当IPTG 浓度为0.2 mmol/L 时，Apx 比酶活最大，相比对照提高了25%，当IPTG 的浓度小于0.2 mmol/L，比酶活随浓度的升高有一定程度的提高，当IPTG 的浓度继续升高时，比酶活下降(图4 A)。当IPTG 诱导时间为10 h 时，比酶活达到最大，小于10 h 时，随诱导时间的加长，比酶活有显著的提高，当诱导时间大于10 h 时，比酶活较10 h下降了28% (图4 B)。分析原因可能是在诱导前期，菌体的活力及蛋白表达量逐渐升高，蛋白降解率低，酶活升高;随诱导时间的延长(＞10 h)，菌体活力明显下降，蛋白表达量降低，蛋白降解率升高，酶活降低。

温度对重组蛋白的表达有显著影响，有研究报道表明，在较低温度(23℃)下，菌体的比生长速率较低，但菌体不易自溶，菌体活力及质粒稳定性升高，代谢副产物的生成减少，蛋白表达更多。并且低温降低了热激蛋白及蛋白酶的合成，也降低了重组蛋白的合成速率，使之与蛋白的折叠速率更相近，更多的形成可溶的有活性的蛋白。温度太低(16℃)，菌体的生长明显受抑制，蛋白表达不足，酶活降低［14］。本文中诱导温度为23℃(图4 C)，Apx 比酶活达到最高，温度太低(16℃)或太高(37℃)，都会影响重组蛋白的表达。

图4 表达条件对重组蛋白Apx 酶活性的影响Fig.4 Effect of expression conditions on recombinant Apx activity

2.4 重组蛋白纯化及酶最适反应条件

将重组蛋白经Ni2+柱纯化，去除杂蛋白(图3)，并进行酶的最适pH 和温度测定。结果表明:该酶的最适pH 值为6.5，当pH 在4 ～7.5 时，酶活均为最高酶活的80%以上(图5)。最适温度为40℃，而当温度在30 ～40℃时，酶活均较高，在最高酶活的90%以上，且变化不显著(图6)。

图5 pH 对Apx 酶活性的影响Fig.5 Effect of pH on Apx activity

图6 温度对Apx 酶活性的影响Fig.6 Effect of temperature on Apx activity

3 结论

研究叶菜类植物Apx 的性质，对于控制采后蔬菜品质的变化具有十分重要的意义。与直接从芥蓝中提取Apx 相比，芥蓝apx 基因在工程菌中表达，具有培养周期短、成本低、表达过程易于控制等诸多优点，且apx 基因受启动子基因调控，通过外源物添加及诱导条件优化等方法可诱导apx 高效表达。此外，在apx 基因两端添加His 标签，容易分离纯化Apx，为更好地研究其酶学性质、蛋白结构及生物学特性等奠定了基础。本研究主要得到了以下结论:

首先，通过RNA 提取，RT-PCR，RACE 等从芥蓝幼苗中扩增出了apx 基因全序列，在NCBI 库中比对，初步证实为胞质apx。与甘蓝apx 相似度高达99%。其次，用双酶切的方法构建了pET-28a-apx，并在E.coil BL21 中成功表达。通过诱导条件的单因素优化，得到apx 诱导表达的最适条件为:添加0.2 mmol/L IPTG，23℃诱导培养10 h。最后，用AKata avant 纯化系统及镍柱纯化出电泳纯Apx，得出pH6.5 和40℃是该酶的最适反应条件。

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