蜂胶乙醇提取液对杏鲍菇及污染菌的抑制作用*

杨鑫，范家恒，段甯耀，赵风云

(昆明理工大学食品工程研究中心，云南 昆明，650500)

杏鲍菇(Pleurotuseryngii)又名刺芹侧耳，是近年来在我国发展较快的工厂化栽培珍稀食用菌新品种［1］。杏鲍菇肉质肥厚，味道鲜美，营养丰富，经常食用具有降血脂、降胆固醇、增强机体免疫力的功效，备受消费者的青睐［2］，成为我国近年来发展最快的食用菌品种之一。杏鲍菇优良菌种的有效保藏，减少在储藏过程中杂菌污染和菌种退化，对于提高企业生产效率具有重要意义。

蜂胶是西方蜜蜂(Apismellifera)采集植物树脂，并混入蜂蜡、花粉及蜜蜂腺体分泌物后经蜜蜂咀嚼加工而成的一种黏稠物质［3］。研究发现，蜂胶的抑菌活性［4］、抗氧化活性［5］、杀虫性［6］、抗肿瘤［7］等药理学活性与其中的黄酮类化合物有密切关系，因此黄酮类化合物的含量常作为蜂胶质量控制的一个重要指标。

Sawaya 等人发现，不同提取方法和提取溶剂获得的蜂胶，其化学成分和抑菌活性各有不同［8］。Garedew 比较了多个国家蜂胶提取物的抗菌效果，发现蜂胶醇提物抗菌活性最高［9］。本试验用蜂胶的乙醇提取液对杏鲍菇及常见污染菌的抑制作用进行了研究，探讨以蜂胶的天然抑菌能力在杏鲍菇菌种保藏和生产过程中防止杂菌污染的可能性。本研究可为用天然抗菌剂防止杏鲍菇菌种污染，预防菌种退化，延长菌种保藏提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

粗蜂胶:采于云南西双版纳，-20℃下冷冻24 h，粉碎备用;杏鲍菇:实验室保藏菌种。

污染菌:为从污染的试管斜面中分离获得，经初步鉴定，霉菌为青霉属菌(Penicillium spp. )，细菌为革兰氏阳性杆菌。

马铃薯综合培养基(potato dextrose agar medium，PDA):马铃薯20%，葡萄糖2%，KH2PO40.3%，Mg-SO40.15%，琼脂2%，pH 自然。

牛肉膏蛋白胨培养基(beef-protein agar medium，BPA):牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，NaCl 1.5%，琼脂2%，pH 自然。

1.2 仪器与设备

AL204 电子分析天平，中国梅特勒-托利多(上海)有限公司;UV -2550 紫外-可见分光光度计，日本岛津公司;ES-315 高压灭菌锅，日本TOMY KOGYO 公司;KQ-500DB 超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蜂胶提取液的制备

乙醇常温提取法:称取10 g 粗蜂胶于三角瓶中，分别加75%、85%、95%乙醇各75 mL，浸提1 h 后，45 kHz 超声波处理15 min，取出30℃浸提24 h，浸提后以5 000 r/min 离心15 min，用滤纸过滤，得到蜂胶提取液。

乙醇热提法:称取10 g 粗蜂胶于三角瓶中，分别加75%、85%、95%乙醇各75 mL，浸提1 h 后，45 kHz超声波处理15 min，取出60℃浸提24 h，浸提后以5 000 r/min 离心15 min，用滤纸过滤，得到蜂胶提取液。

1.3.2 黄酮含量的测定

分别吸取芦丁标准液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 于25 mL 容量瓶中，加6 mL 水，加质量分数为5%的NaNO3溶液1 mL，摇匀，放置6 min。加质量分数10% NaOH 溶液10 mL，加水稀释至刻度，放置15 min，用UV-2550 紫外-可见分光光度计在515 nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线［10］。

黄酮含量的测定:用移液枪量取1mL 6 种不同醇提工艺的蜂胶提取液，用95%乙醇定容于100 mL 容量瓶中，各取1 mL 分别置于25 mL 容量瓶中，加水至6 mL，其余按芦丁标准曲线操作步骤处测定其吸光度，计算出样品中总黄酮含量。

1.3.3 蜂胶提取液抑菌试验

将6 种蜂胶提取液，用蒸馏水分别稀释成0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%的浓度。稀释成不同的浓度梯度，0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌，收集滤液进行抑制试验，方法如下:

杏鲍菇、霉菌:吸取1 mL 蜂胶稀释液用无菌L 棒涂布于接种于PDA 平板，接种杏鲍菇和青霉菌，28℃恒温培养，空白组为蒸馏水，72 h 后测定菌落直径，每组实验设3 个平行，计算抑制率。

细菌:制备浓度为1 ×106CFU 细菌菌悬液，涂布于BPA 平板上，37℃恒温培养，待其长满培养基后，用打孔器取直径为6 mm 的菌块，然后接种至涂布有蜂胶稀释液的BPA 平板上，空白组为蒸馏水，48 h 后测定抑菌圈直径，每组实验设3 个平行，计算抑制率。

2 结果与分析

2.1 蜂胶的黄酮含量

以芦丁作为标品，绘制标准曲线得回归方程为y=10.95x-0.0042(R2=0.999 7)，式中:y 为浓度，mg/mL;x 为吸光值。依据此方程可求出蜂胶提取液的黄酮含量。结果如表1 所示，75%的乙醇热提法提取的黄酮含量显著高于其他提取方法，为10.51mg/ml;相同乙醇浓度时，热提比常温提得到的黄酮含量差异不显著。乙醇浓度的高低对提取率的影响较显著，相同提取温度时，75%的乙醇浓度得到的黄酮含量最多，与吴玉敏得出的70 ～80%乙醇浓度对黄酮的提取效果最好相一致［11］。本试验的黄酮含量偏低，可能与采集的蜂胶为粗蜂胶，蜂蜡等杂质含量过高有关。

表1 6 种蜂胶醇提工艺的黄酮含量对比Table 1 Comparison of the flavonoids content of six propolis ethanol-extractions

2.2 蜂胶醇提工艺对杏鲍菇及污染菌的抑制作用

由图1、图2 和图3 可知，蜂胶提取液对杏鲍菇、霉菌和细菌的抑制作用趋势相似，随着蜂胶提取液浓度增加，抑制率增大，抑制作用增强;6 种工艺获得的蜂胶提取液，均对杏鲍菇及污染菌有抑制作用，抑菌效果最优的醇提工艺是75%的乙醇热提，在蜂胶提取液浓度为80%时，对细菌的抑菌百分比达到100%(致死浓度)。

图1 不同的蜂胶醇提工艺对杏鲍菇的抑制曲线Fig.1 The restrain curve of different propolis ethanol-extraction process to Pleurotus eryngii

图2 不同的蜂胶醇提工艺对霉菌的抑制曲线Fig.2 The restrain curve of different propolis ethanol-extraction process to Streptomyces

图3 不同的蜂胶醇提工艺对细菌的抑制曲线Fig.3 The restrain curve of different propolis ethanol-extraction process to bacterial

对比蜂胶提取液对杏鲍菇、霉菌和细菌的抑菌效果可知:蜂胶提取物对细菌的抑制作用最强，其次是杏鲍菇，对霉菌的抑制作用最弱。说明在杏鲍菇菌种保藏中，添加适量的蜂胶提取液，可有效抑制细菌的污染，但对控制霉菌的污染没有太大效果。

2.3 黄酮含量和蜂胶提取物抑菌效果的相关性分析

对蜂胶中的黄酮含量和蜂胶提取物对杏鲍菇及污染菌的抑菌效果进行相关性分析。由图4 可知，杏鲍菇、霉菌和细菌的抑制率与黄酮含量的相关系数R12、R22、R32均大于0.8，说明黄酮含量和抑菌效果有相关性，黄酮含量增加影响着抑菌效果，黄酮含量越高的蜂胶提取液抑菌效果越强，与Pepeljnjak 等的结论，蜂胶抗菌效果和蜂胶中黄酮类物质含量成正比的结论相一致［12］。也进一步验证了，黄酮类物质是一种重要的抗菌活性成分［13］。

图4 黄酮含量和杏鲍菇及污染菌抑制作用的相关性分析Fig.4 Flavonoid content，Pleurotus eryngii and contaminating bacteria inhibition of correlation analysis

3 结论

本研究以云南西双版纳的粗蜂胶为原料，进行75%、85%、95%的乙醇常温浸提和热浸提，测定蜂胶提取液的黄酮含量，并进行杏鲍菇及污染菌的抑制作用研究，结果表明:75%的乙醇热提法提取的黄酮含量最多，蜂胶提取液对细菌有较强的抑制作用，但对霉菌、杏鲍菇的抑制效果较差，杏鲍菇、霉菌和细菌的抑制率与黄酮含量的相关系数均大于0.8，有较强的相关性。本研究表明:在杏鲍菇菌种保藏和子实体的保鲜时，添加适量的蜂胶提取液，可有效抑制细菌的污染。

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［2］ 刘凌岱，王希，周谢，等. 杏鲍菇脯的加工工艺研究［J］. 安徽农业科学，2012，12(4):2 301 -2 303.

［3］ Bankova V S，Castro S L，Marcucci M C，et al. Propolis:recent advances in chemistry and plant origin［J］. Apidologie，2000，31(1):3 -15.

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［5］ Lima B，Tapia A，Luna L，et al. Main Flavonoids，DPPH activity，and metal content allow determination of the geographical origin of propolis from the province of San Juan(Argentina)［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57(7):2691 -2698.

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