双抗体间接夹心ELISA法检测血清MUC1蛋白方法的建立及其在肺癌诊断中的应用

何秋立，张 旭，王 娟，翟瑞萍，乔彩霞，孙霞霞，倪维华，高素君，台桂香

（1.吉林大学第一医院肿瘤中心，吉林 长春 130021；2.吉林大学白求恩医学院免疫学教研室，吉林 长春 130021）

肺癌是当前世界各地发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，早期诊断对其预后有重要意义［1］。但是肺癌的早期诊断仍是临床工作者面临的难题，血清肿瘤标志物的检测为解决该难题提供了新的研究方向［2］。黏蛋白1（mucin 1，MUC1）是黏蛋白家族的重要成员，属于跨膜糖蛋白。在肿瘤细胞中，细胞骨架破坏，导致其胞外段脱落形成血清MUC1。在乳腺癌、卵巢癌和肺癌等多种实体肿瘤及部分血液系统恶性肿瘤中，均存在MUC1的高表达，MUC1是一种非常有价值的肿瘤标志物［3－4］，其中血清 MUC1作为检测乳腺癌的肿瘤标志物，对疾病诊断及预后有重要意义，已得到大量临床资料［5－6］的证实。临床上广泛应用 CA15－3试剂盒检测血清MUC1表达水平，该试剂盒以单克隆抗体为包被抗体和检测抗体，只针对某一免疫表位，针对肺癌的检出率低［7－9］，在实验室前期制备兔抗人MUC1多克隆抗体的基础上［10］，本文作者首次尝试改善检测抗体为多克隆抗体，建立一种新的检测血清 MUC1的酶联免疫吸附法（enzymelinked immunesorbent assay，ELISA）试剂盒，对48例肺癌患者的血清MUC1进行检测，并与临床上常用的CA15－3试剂盒进行比较，评估其在肺癌诊断中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象 肺癌组为48例肺癌患者，均为2011年2—5月于吉林大学第一医院胸外科和肿瘤科的住院患者，经术后病理确诊。肺癌组患者年龄35～73岁，平均年龄59岁；其中男性28例，女性20例；腺癌26例，鳞癌15例，小细胞肺癌7例。肺良性疾病组为7例同期本院呼吸科住院患者，诊断为肺炎或肺结核；其中男性4例，女性3例，平均年龄60岁。健康对照组选取20例同期在本院体检中心体检合格的正常人群；其中男性12例，女性8例，平均年龄58岁。各组患者均经吉林大学第一医院伦理委员会允许并与实验参与者签署知情同意书。

1.2 主要试剂和仪器 鼠抗人MUC1单克隆抗体GP1.4（美国Neo marker公司），MUC1标准品及兔抗人MUC1多克隆抗体（吉林大学白求恩医学院免疫学教研室提供），山羊抗兔IgG－HRP（美国Sigma公司）；CA15－3试剂盒（Roche公司），全自动电化学发光免疫分析仪（罗氏诊断公司）。

1.3 血清采集 收集研究对象的空腹静脉血，肝素抗凝，室温放置30min，4℃放置过夜，次日3000r·min－1离心20min。收集血清，放置－20℃保存。检测前先放置4℃融化，然后置室温平衡后使用。

1.4 双抗体间接夹心ELISA方法的建立 应用棋盘滴定法选择包被抗体、检测抗体、酶标抗体的最佳工作浓度。以鼠抗人MUC1单克隆抗体为包被抗体，采用5个质量浓度（0.02、0.10、0.20、0.40和1.00mg·L－1）包被酶标板，2%BSA 封闭；加入倍比稀释的 MUC1蛋白标准品（0.5、1.0、 2.0、 4.0、 8.0、 16.0、 32.0 和64.0μg·L－1）；再以兔抗人MUC1多克隆抗体作为检测抗体，抗体设5个稀释浓度（20.0、15.0、10.0、5.0和2.5mg·L－1）；然后加入山羊抗兔HRP酶标抗体，采用5个稀释浓度（1∶2500、1∶5000、1∶10000、1∶20000和1∶40000）；加入底物OPD溶液显色；2mol·L－1的H2SO4终止反应，经酶标仪检测在490nm波长处的吸光度（A）值。根据检测结果确立双抗体夹心ELISA方法的最佳实验条件、敏感度及标准曲线。通过绘制受试者工作特征曲线（receive operating characteristic curve，ROC）确定最佳cut－off值。ROC是反映敏感度和特异度连续变量的综合指标，通过构图法揭示敏感度和特异度的相互关系，其通过将连续变量设定出多个不同的临界值，从而计算出一系列敏感度和特异度，再以敏感度为纵坐标、假阳性率（1－特异度）为横坐标绘制出曲线，曲线下面积（area under curve，AUC），记为Az。Az＝0.5表示完全无价值的诊断，Az＝0.5～0.7表示诊断准确性较低，Az＝0.7～0.9表示诊断准确性中等，Az＝0.9～1.0表示诊断准确性较高，Az＝1表示完全理想的诊断。cut－off值取自ROC上敏感度和特异度最佳平衡位点所对应的数值，从而使实验的敏感度和特异度均达到较高的水平，使误诊率和漏诊率均处于较低水平。特异度＝真阴性／（假阳性＋真阴性），敏感度＝真阳性／（真阳性＋假阴性）。约登指数＝敏感度＋特异度－1，其表示筛选方法发现真正的患者与非患者的能力，指数越大说明效果越好，真实性越大。

1.5 血清MUC1的测定 应用本研究建立的双抗体间接夹心ELISA方法，按上述步骤，采用设置好的最佳实验条件检测肺癌组、肺良性疾病组和健康对照组研究对象外周血清MUC1表达水平。同时，严格按照CA15－3试剂盒的说明书操作，应用罗氏全自动电化学发光免疫分析仪检测各组研究对象血清MUC1表达水平。

1.6 统计学分析 采用SPSS 17.0软件包进行统计学处理，各组血清MUC1蛋白表达水平为非正态分布数据，表示为中位数（P25，P75），总体比较采用非参数Kruskal－Wallis检验，两两比较采用Mann Whitney检验。

2 结 果

2.1 双抗体间接夹心ELISA方法中各组分最佳反应浓度及敏感度 通过棋盘滴定法对包被抗体、检测抗体和酶标抗体进行不同的组合筛选，最后确定试剂盒各个组分最佳工作浓度为：包被抗体（GP1.4抗体）每孔 0.1μg；检测抗体（兔抗人MUC1多克隆抗体）的工作浓度为15mg·L－1；酶标抗体IgG－HRP最佳稀释比例为1∶5000。MUC1标准品稀释为8个浓度：0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0和64.0μg·L－1。采用上述条件，采用本研究建立的双抗体间接夹心ELISA方法对不同浓度的MUC1蛋白标准品进行检测，绘制出标准曲线，敏感度最高为0.5μg·L－1。见图1。

2.2 血清MUC1蛋白表达水平检测结果 应用建立的MUC1双抗体间接夹心ELISA法，对48例肺癌患者、7例肺良性疾病患者和20例健康体检者外周血清中MUC1蛋白表达水平进行检测。肺癌组血清 MUC1蛋白平均浓度为2.70（1.64，4.07）μg·L－1，肺良性疾病组血清MUC1蛋白平均浓度为1.21（0.94，1.33）μg·L－1，健康对照组血清 MUC1蛋白平均浓度为1.44（1.22，1.66）μg·L－1。肺癌患者血清MUC1蛋白表达水平明显高于肺良性疾病组与健康对照组（P＜0.01）；肺良性疾病组与健康对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。应用CA15－3试剂盒检测血清MUC1蛋白水平：肺癌组患者血清MUC1蛋白平均浓度高于肺良性疾病组和健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

图1 双抗体间接夹心ELISA法的标准曲线Fig.1 Standard curve of double－antibody indirect sandwich ELISA

表1 间接夹心ELISA法与CA15－3试剂盒检测各组血清MUC1蛋白表达水平Tab.1 The serum MUC1protein expression levels in various groups detected by indirect sandwich ELISA and CA15－3kit ［M（P25，P75）］

2.3 双抗体间接夹心ELISA法确定血清 MUC1正常值 应用本研究建立的ELISA试剂盒检测肺癌组和非肺癌组患者的血清MUC1蛋白表达水平后，并应用SPSS 17.0进行统计学分析，分别计算出所有截断点的敏感度和假阳性率（1－特异度），确定cut－off值，得出肺癌患者与非肺癌组最佳cut－off值为1.98μg·L－1，Az＝0.87。

2.4 双抗体间接夹心ELISA法与CA15－3试剂盒检测结果比较 根据双抗体间接夹心ELISA法的检测结果和通过ROC曲线确定的cut－off值，再进行进一步分析。48例肺癌患者中有30例血清MUC1蛋白表达水平大于1.98μg·L－1，为阳性；20例健康对照及7例肺良性疾病患者均为阴性。应用罗氏全自动电化学发光免疫分析仪检测血清MUC1表达水平，根据CA15－3试剂盒说明书提供的cut－off值（25U·mL－1），48例肺癌患者中9例为阳性；20例健康对照及7例肺良性疾病患者均为阴性。本研究建立的ELISA试剂盒检测肺癌血清 MUC1的敏感度为62.5%（30／48），特异度为100%（27／27），约登指数为0.6250；CA15－3试剂盒检测肺癌的敏感度为18.75%（9／48），特异度为100%（27／27），约登指数为0.1875。

图2 双抗体间接夹心ELISA法检测肺癌组与非肺癌组血清MUC1蛋白表达水平的ROCFig.2 The ROC of MUC1protein expression levels in lung cancer group and non－lung cancer group detected by doubleantibody indirect sandwich ELISA method

3 讨 论

针对临床上CA15－3试剂盒敏感度低的局限性，本文作者通过改善检测抗体为多克隆抗体，成功建立了一种新的双抗体间接夹心ELISA试剂盒，并对本院的肺癌患者、肺良性疾病患者及健康对照者血清MUC1蛋白水平进行检测，通过ROC确定最佳cut－off值，并将检测结果与CA15－3试剂盒比较，本研究建立的试剂盒在保持特异度的同时，明显提高了检测肺癌的敏感度及真实性。多项临床研究［7－9］用已经商业化的ELISA方法、化学发光免疫法和电化学发光等不同方法检测肺癌患者血清MUC1表达水平，其敏感度均在20%左右，均低于本研究建立的双抗体间接夹心ELISA法。有研究［11］应用放射免疫法检测血清 CA15－3（MUC1）水平，其诊断肺癌的敏感度和特异度分别为62.68%和88.00%。但是ELISA仍存在高特异度、操作简单和方便等优势。

本研究建立的双抗体间接夹心ELISA方法在保持特异度的同时，也提高了敏感度，原因可能如下：目前，商业化试剂盒均选用单克隆抗体作为包被抗体和检测抗体，由于不同肿瘤在不同个体中所暴露的MUC1抗原表位不同，单克隆抗体的应用虽大大提高了识别抗原的特异度，但由于单克隆抗体的结合表位单一，因此可能漏诊许多阳性病例。本文作者根据夹心ELISA的原理，将针对MUC1的一种单克隆抗体包被，加入待检样本，待测抗原与固相载体表面的抗体形成抗原抗体复合物，再次加入针对MUC1蛋白的一种多克隆抗体形成双抗体夹心免疫复合物；然后加酶标抗体。由于检测抗体（二级抗体）为多克隆抗体，可与抗原多个表位结合，降低了漏检率，在此基础上又比商业化双抗体夹心ELISA多加了一层抗体，放大倍数再次增高，因此大大提高了敏感度。而由于包被抗体仍是单克隆抗体，从而保证了该实验的特异度。

在建立合理检测方案的同时把肿瘤标志物检测作为一项常规的针对于高危人群的肿瘤筛查方法是一种趋势［12］，只有这样才能真正实现肺癌的早期发现、早期治疗，有效提高患者的生存率。本研究建立的ELISA试剂盒与临床上常用的CA15－3试剂盒比较，检测肺癌的敏感度及真实性得到明显提高，且特异度高，稳定性好，操作简单、快速，普及比较方便，有望用于恶性肿瘤的早期诊断和风险人群的肿瘤筛选检查等。如果将其进一步优化，包被抗体和检测抗体均采用多克隆抗体，并联合检测其他肿瘤标志物，肺癌检测的敏感度可能会得到进一步提高。但是为了更好地验证该方法的可行性和优越性，还需要扩大研究样本量，需要更多临床资料的积累和大规模前瞻性研究。

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