紫外分光光度法在没食子酸体外还原Fe3＋能力检测中的应用及其意义

伍翔群，于 兰，于 杰，黄彩婷，许维国，牛凤兰

（1.吉林大学公共卫生学院卫生检验学教研室，吉林 长春 130021；2.长春中医药大学附属医院脑病科，吉林 长春 130021；3.吉林大学中日联谊医院电诊科，吉林 长春 130033）

没食子酸（gallic acid，GA）是一种广泛存在于水果和中草药等植物中的天然酚酸类化合物，是没食子、余甘子、藏青果、红景天和诃子等中药材的药理活性组分，也是一些纯中药制剂的有效成分。研究［1－4］表明：GA具有较强的抗氧化性，具有抗菌、抗病毒和抗肿瘤作用。研究［5－7］证明：GA通过抗氧化作用抑制小鼠红细胞溶血活性，抑制小鼠脑、肾匀浆脂质过氧化作用，对大鼠的缺血－再灌注损伤起保护作用，对与1型糖尿病相关的心肌损伤的治疗有效等。大多数人工合成抗氧化剂均具有一定的毒副作用，与此相比，GA作为天然的抗氧化剂安全无毒并具有良好的生理功效。因此，检验GA的抗氧化性可为其应用提供实验依据。抗坏血酸，即维生素C（vitamin C，Vc），为水溶性维生素，具有极强的还原性，在食品加工业中被广泛使用，故本研究采用Vc作为抗氧化对照药。H2O2／Fe2＋体系可通过Fenton反应使邻二氮菲－Fe2＋被羟自由基氧化为邻二氮菲－Fe3＋［8］，因此，应用紫外分光光度计检测Vc或GA还原Fe3＋的产物的吸光度（A）值，可间接检测其抗氧化能力。在铁氰化钾－Fe3＋体系中以Fe3＋做氧化剂，定量氧化Vc或GA并生成Fe2＋，后者可在一定条件下与显色剂生成蓝色配合物 KFe3＋［Fe2＋（CN）6］。通过分光光度法测定该配合物的A值，建立间接测定受试物抗氧化能力的方法［9］。本研究采用上述2种体系测定GA的体外抗氧化能力，结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 邻二氮菲（天津市北方天医化学试剂厂），配置成浓度为5mmol·L－1邻二氮菲乙醇溶液；30%过氧化氢（北京化工厂），配置成1%过氧化氢溶液；铁氰化钾（天津市化学试剂一厂），配置成10g·L－1铁氰化钾溶液；自制0.01和0.10mol·L－1PBS缓冲溶液；盐酸（北京化工厂）12mol·L－1，用去离子水稀释10000倍后为1.2×10－3mol· L－1和稀释100倍后 为0.12mol·L－1；GA（北京化工厂）、Vc（吉林显峰科技制药有限公司），各配置成浓度为1.6g·L－1溶液；硫酸亚铁（北京化工厂），配置成浓度为7.5mmol·L－1硫酸亚铁溶液；氯化铁（北京化工厂），配置成1g·L－1氯化铁溶液。所有试剂均为分析纯，水为二次去离子水。PE Lambda 900紫外可见分光光度计（美国PE公司），水浴箱和电子天平（上海实验仪器厂），超声波振荡器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 紫外分光光度法验证GA和Vc体外抗氧化性的可行性 为了确定最佳测试条件，排除干扰因素，用紫外分光光度计对GA和Vc溶液进行全波长扫描。

1.3 GA和Vc在邻二氮菲－Fe2＋体系中还原Fe3＋能力的检测 在1～9号容量瓶中均依次精密加入邻二氮菲溶液1.5mL，0.01mol·L－1PBS缓冲溶液4mL，硫酸亚铁溶液1mL，立即混匀备用。其中1～4号容量瓶为GA组，5～8号为Vc组，9号为control 1组。在GA组中按顺序依次准确加入GA溶液0.25、0.50、0.75和1.00mL，使1～4号瓶 GA浓度分别为0.04、0.08、0.12 和0.16g·L－1。在Vc组中按顺序依次准确加入Vc溶液0.25、0.50、0.75和1.00mL，使5～8号的Vc浓度分别为0.04、0.08、0.12和0.16g·L－1。随后向1～9号容量瓶中加入过氧化氢溶液各1mL。所有容量瓶用去离子水定容至刻度，混匀，37℃水浴1h。利用紫外分光光度计，于波长为536nm处，用1cm比色皿，以试剂空白为对照，检测其A值。重复3次取平均值。

1.4 乙醇对GA和Vc在邻二氮菲－Fe2＋体系中还原Fe3＋能力影响的检测 取2只洁净容量瓶标记为A和B，向其中各加入邻二氮菲溶液1.5mL，0.01mol·L－1PBS缓冲溶液4mL，硫酸亚铁溶液1mL，混匀备用。A容量瓶用乙醇定容至刻度，B容量瓶用去离子水定容至刻度，混匀，37℃水浴1h。利用紫外分光光度计，于波长为536nm处，用1cm比色皿检测其A值。重复3次取平均值。

1.5 GA和Vc在铁氰化钾－Fe3＋体系中还原Fe3＋能力的检测 在11～19号10mL容量瓶中均依次精密加入氯化铁溶液0.5mL，铁氰化钾溶液2mL，0.01mol· L－1PBS 溶 液 2mL，1.2×10－3mol·L－1盐酸溶液0.5mL，混匀备用。其中11～14号容量瓶为GA组，15～18号为Vc组，19号为control 2组。

在GA组中按顺序依次准确加入GA溶液0.25、0.50、0.75和1.00mL，使 GA 浓度分别为0.04、0.08、0.12和0.16g·L－1。在 Vc组中按顺序依次准确加入 Vc溶液0.25、0.50、0.75和1.00mL，使Vc浓度分别为0.04、0.08、0.12和0.16g·L－1。所有容量瓶用去离子水定容至刻度，混匀，室温反应30min。利用紫外分光光度计，于波长为700nm处，用1cm比色皿，以试剂空白为对照，检测其A值。重复3次取平均值。

1.6 GA和Vc在不同H＋浓度的铁氰化钾－Fe3＋体系中还原Fe3＋能力的检测 在41～48号、C号、D号10mL容量瓶中均依次加入0.1mol·L－1PBS溶液2mL，氯化铁溶液0.5mL，铁氰化钾溶液2mL。在41～44号容量瓶中加入0.12mol·L－1盐酸0.7mL，在45～48号容量瓶中加入0.12mol·L－1盐酸0.8mL，混匀备用。41～44号容量瓶为GA组，45～48号为Vc组，49号为control 3组，50号为control 4组。

在GA组中按顺序依次准确加入GA溶液0.25、0.50、0.75和1.00mL，使其终浓度分别为0.04、0.08、0.12和0.16g·L－1。在 Vc组中按顺序依次准确加入 Vc溶液0.25、0.50、0.75和 1.00mL，使其终浓度分别为 0.04、0.08、0.12和 0.16g·L－1。在C号容量瓶中加入0.12mol·L－1盐酸0.75mL，GA 0.50mL。在D号容量瓶中加入0.12mol·L－1盐酸0.75mL，Vc 0.50mL。在49和50号10mL容量瓶中依次加入0.1mol·L－1PBS溶液2mL，氯化铁溶液0.5mL，铁氰化钾溶液2mL。在49号容量瓶中加入0.12mol·L－1盐酸0.7mL，在50号容量瓶中加入0.12mol·L－1盐酸0.8mL。所有容量瓶用去离子水定容至刻度，混匀，室温反应30min。利用紫外分光光度计，于波长为700nm处，用1cm比色皿，以试剂空白为对照，检测其A值。重复3次取平均值。

1.7 盐酸对GA和Vc在铁氰化钾－Fe3＋体系中还原Fe3＋能力影响的检测 在21～40号10mL容量瓶中均依次加入0.1mol·L－1PBS溶液2mL，氯化铁溶液0.5mL，铁氰化钾溶液2mL。21～30号容量瓶为GA组，31～40号为Vc组。在GA组中按顺序依次准确加入0.12mol·L－1盐酸0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90 和 1.00mL，使其终浓度分别为0.12×10－2、0.24×10－2、0.36×10－2、0.48×10－2、0.60×10－2、0.72×10－2、0.84×10－2、0.96×10－2、1.08×10－2和1.20×10－2mol·L－1；Vc组同GA组操作。在GA组容量瓶中均加入GA溶液0.5mL，Vc组容量瓶中均加入Vc溶液0.5mL。所有容量瓶用去离子水定容至刻度，混匀，室温反应30min。利用紫外分光光度计，于波长为700nm处，用1cm比色皿，检测其A值。重复3次取平均值。

1.8 统计学分析 应用SPSS 17.0软件包进行统计分析，GA与VC组检测指标以表示，组间比较采用two－way ANOVA方差分析。

2 结 果

2.1 紫外分光光度法验证GA和Vc体外抗氧化性的可行性 对GA和Vc溶液进行全波长扫描测得最大吸收峰分别为267.05和260.95nm，而在实验测试条件536及700nm处均无明显吸收，不会对测定结果造成干扰。因此，用比色法测定GA和Vc体外抗氧化能力可行。

2.2 GA和Vc在邻二氮菲－Fe2＋体系中还原Fe3＋的能力 采用SPSS分析得：GA和Vc溶液间A值的比较，均方 MS＝0.005，F＝56.315，P＜0.05，GA组和Vc组A值差异有统计学意义。GA组和Vc组不同浓度溶液A值的比较，均方MS＝0.030，F＝358.194，P＜0.05，GA 组和Vc组不同浓度溶液A值差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。在此体系中所有药物浓度下，GA组的A值均大于Vc组。表明在此体系中GA的体外还原Fe3＋能力强于Vc。

2.3 乙醇作用下GA和Vc在邻二氮菲－Fe2＋体系中还原Fe3＋的能力 用纯乙醇定容的反应液所测A值为1.5491，用去离子水定容的反应液所测A值为1.7278。结果表明：乙醇对试剂的A值有影响。

2.4 GA和Vc在铁氰化钾－Fe3＋体系中还原Fe3＋的能力 采用SPSS分析得：GA和Vc溶液间A值的比较，均方 MS＝1.130，F＝15.568，P＜0.05，GA组和Vc组A值差异有统计学意义。GA组和Vc组不同浓度溶液A值的比较，均方MS＝0.897，F＝12.355，P＜0.05，GA 组和Vc组不同浓度溶液A值差异有统计学意义。见表2。

在0.04g·L－1浓度时，GA的A值大于Vc的A值，即GA的体外还原Fe3＋的能力强于Vc。其余浓度下GA的A值均小于Vc，即在此体系此浓度下GA的体外还原Fe3＋的能力弱于Vc。

2.5 GA和Vc在不同H＋浓度的铁氰化钾－Fe3＋体系中还原Fe3＋的能力 采用SPSS分析得：GA和Vc溶液间A值的比较，均方MS＝0.543，F＝6.871，P＜0.05，GA组和Vc组A值差异有统计学意义。GA组和Vc组不同浓度溶液A值比较，均方 MS＝0.539，F＝6.815，P＜0.05，GA组及和Vc组不同浓度溶液A值差异有统计学意义。见表3。在此体系中不同药物浓度下，GA组的A值均大于Vc组。表明在此体系中GA的体外还原Fe3＋能力强于Vc。

表1 GA和Vc在Fenton羟自由基体系中的A值Tab.1 The A values of GA and Vc in the Fenton hydroxyl radicals system （n＝3，）

表1 GA和Vc在Fenton羟自由基体系中的A值Tab.1 The A values of GA and Vc in the Fenton hydroxyl radicals system （n＝3，）

The A value of control 1was 1.2355±0.0411.＊ P＜0.05compared with Vc group；△P＜0.05compared with 0.04g·L－1 group.

Group 0.04 0.08 0.12 0.16 GA 1.4485±0.1467＊ 1.5904±0.1533＊△ 1.6574±0.1350＊△ 1.8275±0.1451＊A value［ρB／（g·L－1）］△Vc 1.3650±0.1366 1.4754±0.1477△ 1.5414±0.0959△ 1.6570±0.1217△

表2 GA和Vc在铁氰化钾－Fe3＋体系中的A值Tab.2 The A values of GA and Vc in the potassium ferricyanide－Fe3＋system （n＝3，）

表2 GA和Vc在铁氰化钾－Fe3＋体系中的A值Tab.2 The A values of GA and Vc in the potassium ferricyanide－Fe3＋system （n＝3，）

The A value of control 2was 0.0669±0.0000.＊ P＜0.05compared with Vc group；△P＜0.05compared with 0.04g·L－1 group.

Group 0.04 0.08 0.12 0.16 GA 0.3055±0.0017＊△ 0.4966±0.0044＊△ 0.6734±0.0008＊△ 0.8864±0.0008＊A value［ρB／（g·L－1）］△Vc 0.0861±0.0008△ 1.1845±0.0056△ 1.5919±0.0010△ 1.6257±0.0006△

表3 GA和Vc在不同H＋浓度的铁氰化钾－Fe3＋体系中的A值Tab.3 The A values of GA and Vc in the potassium ferricyanide－Fe3＋system with different concentrations of H＋（n＝3，）

表3 GA和Vc在不同H＋浓度的铁氰化钾－Fe3＋体系中的A值Tab.3 The A values of GA and Vc in the potassium ferricyanide－Fe3＋system with different concentrations of H＋（n＝3，）

The A value of control 3was 0.0618±0.0001；the A value of control 4was 0.0606±0.0000；the A value of C was 1.5917±0.0026；the A value of D was 0.1334±0.0009.＊ P＜0.05compared with Vc group；△P＜0.05compared with 0.04g·L－1 group.

Group 0.04 0.08 0.12 0.16 GA 0.1381±0.0038＊ 0.2239±0.0041 0.8755±0.0023＊△ 1.7094±0.0014＊A value［ρB／（g·L－1）］△Vc 0.1009±0.0047 0.2802±0.0058 0.4521±0.0014△ 0.5473±0.0017△

2.6 不同浓度盐酸作用下GA和Vc在铁氰化钾－Fe3＋体系中还原Fe3＋的能力 采用SPSS分析得：GA和Vc溶液间A值的比较，均方MS＝0.112，F＝1.920，P＞0.05，GA组和Vc组A值差异无统计学意义。GA组和Vc组不同盐酸浓度溶液A值的比较，均方 MS＝1.022，F＝17.524，P＜0.05，GA组和Vc组不同盐酸浓度溶液A值差异有统计学意义。见表4。在相同浓度的盐酸溶液中GA和Vc的A值差别大。Vc组盐酸浓度为0.84×10－2和0.96×10－2mol·L－1的溶液 A值呈跳跃性改变，跃至A值最大值。

3 讨 论

氧化应激是指机体活性氧物质产生过多，机体抗氧化能力降低，氧化系统和抗氧化系统平衡紊乱导致组织或细胞损伤的病理过程。在病理条件下或衰老时，细胞内活性氧的增加超过抗氧化防御能力，就会引起脂质、蛋白质和DNA的氧化损伤，可能导致动脉粥样硬化、心力衰竭、高血压等心血管疾病的发生［10］。研究［11］显示：临床上现有的具有抗氧化作用的药物治疗效果具有一定局限性，从中药或者天然植物药中筛选抗氧化活性成分，以此为基础开发新药是解决此问题的有效途径之一。在体外模拟氧化体系下GA的抗氧化作用研究成为关注的焦点。在邻二氮菲－Fe2＋体系中，加入硫酸亚铁溶液后必须立即混匀，否则会使局部颜色过浓影响实验结果的重复性。较多的乙醇对实验结果有影响，故在邻二氮菲－Fe2＋体系中测定物质抗氧化性时应考虑乙醇的还原性，对乙醇的影响进行校正或更换溶剂。在铁氰化钾－Fe3＋体系中，低浓度GA在H＋浓度较小的环境下体外还原Fe3＋能力较强，高浓度GA在H＋浓度较大的环境下体外还原Fe3＋能力较强。Vc则在H＋浓度较小的环境下体外还原Fe3＋能力较强。因此，在GA的应用中应考虑剂量与体系H＋浓度对其抗氧化性的影响。

表4 不同浓度盐酸作用下GA和Vc在铁氰化钾－Fe3＋体系中的A值Tab.4 The A values of GA and Vc in the potassium ferricyanide－Fe3＋ system after treated with different concentrations of HCl （n＝3，）

表4 不同浓度盐酸作用下GA和Vc在铁氰化钾－Fe3＋体系中的A值Tab.4 The A values of GA and Vc in the potassium ferricyanide－Fe3＋ system after treated with different concentrations of HCl （n＝3，）

＊ P＜0.05compared with 0.12×10－2 mol·L－1 group.

Group 0.24 0.36 0.48 0.60 GA 0.2085±0.0043 0.2676±0.0011 0.2236±0.00 A value（×10－2 mol·L－1）0.1258 0.2127±0.0037 0.2067±0.0033 Vc 0.0609±0.0021 0.0625±0.0031 0.0624±0.0022 0.0716±0.0060 0.0772±0.0018 Group 0.84 0.96 1.08 1.20 GA 0.1986±0.0009 1.2607±0.0056＊ 1.5134±0.0019＊ 1.6326±0.0003＊ 1.6165±0.0008 A value（×10－2 mol·L－1）0.72＊Vc 0.0842±0.0035 0.2310±0.0025＊ 1.7380±0.0034＊ 1.7040±0.0006＊ 1.7525±0.0012＊

本实验结果显示：Vc组盐酸浓度为0.84×10－2和0.96×10－2mol·L－1的溶液 A值呈跳跃性改变，跃至 A值最大值。盐酸浓度为0.84×10－2mol·L－1时为GA反应的适宜酸度，此条件下Vc组溶液的A值过小，不利于低剂量Vc反应液的A值检测。C号溶液即GA的A值为1.5917，接近实验可得最大A值，而D号溶液即Vc的A值为0.1334，接近实验可得最小吸光度。可见，GA和Vc的最佳反应体系的条件并不一致，可能是两者本身化学结构差异所致。研究［12］表明：没食子酸在碱性、中性、强氧化条件下不稳定，在酸性环境、强光、高温条件下稳定，而不同的抗氧剂对其均有保护作用。且盐酸浓度对实验结果影响很大，试剂加入顺序也对实验结果有一定的影响。研究［13］表明：Fe3＋在不同pH值条件下的化学形态不同，催化活性差异较大，影响化学发光特性。因此在实验过程中应控制盐酸浓度。

本实验结果表明：GA在体外一定条件下的抗氧化能力强于Vc，而Vc是公认的抗氧化剂，说明GA在抗氧化方面具有良好的应用前景。

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