氯胺酮对幼龄小鼠自主活动的影响和致遗忘作用及其与GABAA、NMDA受体的关系Δ

高艳，赵佳佳，陈雪，高震，李伟，傅焓，张科学，戴体俊，王红军，张洋（徐州医学院麻醉学院，江苏徐州 221002）

氯胺酮（Ketamine，Ket）是临床上常用的非巴比妥类静脉麻醉药，具有明显的镇痛作用[1]，在小儿麻醉的应用中极为普遍。近年来，有研究[2]显示，麻醉剂可能导致幼儿术后行为和发育问题。在体、离体动物实验[3]也证明，在脑发育的高峰期，接受临床剂量全身麻醉药可使哺乳动物发育期脑神经元产生损伤。另有众多研究[4-5]发现，γ-氨基丁酸 A（GABAA）受体和N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体是许多全身麻醉药的作用靶位，二者又均与记忆密切相关[6]。氯胺酮对成年小鼠具有致遗忘作用[7]也已被证实。但氯胺酮对幼龄小鼠自主活动的影响和致遗忘作用及其相关靶位未见文献报道。故本实验旨在阐明氯胺酮对幼龄小鼠自主活动的影响和致遗忘作用，及其在此过程中与GABAA、NMDA受体的关系，为临床用药提供参考。

1 材料

1.1 仪器

YLS-1A多功能小鼠自主活动记录仪（山东省医学科学院设备站）；ZH-500小鼠避暗仪（安徽省淮北正华生物仪器设备有限公司）；DT-200小鼠跳台测试箱（成都泰盟科技有限公司）。

1.2 药品与试剂

盐酸氯胺酮注射液（福建古田药业有公司，批号：100817，规格：0.1 g∶2 ml）；荷包牡丹碱（Bic，注射用无菌粉末，批号：44007045，规格：每支10 mg）和NMDA（注射用无菌粉末，批号：29k1198，规格：每支25 mg）均购自美国Sigma公司；人工脑脊液（aCSF，徐州医学院教研室提供）。

1.3 动物

昆明种幼龄小鼠240只，清洁级，♀♂各半，8～10 d龄，体质量8～13 g，由徐州医学院实验动物中心提供，许可证编号：SCXK（苏）2010-0003。

2 方法

2.1 分组与给药

将小鼠随机均分为3大组分别用于自主活动、避暗和跳台实验，每大组再各分为8小组（n＝10）：A组[生理盐水（NS）+aCSF]、B组（氯胺酮+aCSF）、C和D组（NS+Bic 0.10、0.20 mg/kg）、E和 F组（氯胺酮+Bic 0.10、0.20 mg/kg）、G 组（NS+NMDA 60 ng）、H组（氯胺酮+NMDA 60 ng）。氯胺酮100 mg/kg或NS于测试前20 min腹腔注射，aCSF或Bic或NMDA于测试前5 min侧脑室注射。Bic和NMDA均以aCSF稀释，侧脑室注射容积均为每只5 μl，注射时间为5 s。氯胺酮以NS稀释，腹腔注射容积均为10 ml/kg。

2.2 自主活动实验

自主活动组小鼠侧脑室注射药物15 min后，用多功能小鼠自主活动记录仪测试其5 min内的自主活动次数（Spontaneous motor activity times，SMATs）。

2.3 避暗实验[8]

实验前，先将未给药的避暗实验组小鼠放入反应箱内适应环境3 min，然后取出、给药。向暗室底部铜栅通36 V、50 Hz交流电，再将侧脑室注射药物5 min后的避暗实验组小鼠背对洞口放入明室，小鼠进入暗室则受到电击，如此训练5 min。训练后24、48 h重复实验。记录小鼠第1次进入暗室的时间（即避暗潜伏期）和5 min内受到的电击次数（即错误次数）。若小鼠5 min未进入暗室，错误次数记为0次，避暗潜伏期记为300 s。

2.4 跳台实验[8]

实验前，先将未给药的跳台实验组小鼠放入反应箱内适应环境3 min，然后取出、给药。将侧脑室注射药物5 min后的跳台实验组小鼠放入反应箱，以36 V、50 Hz交流电给予电击，小鼠受电击，正常反应是跳回平台以躲避伤害性刺激。多数小鼠可能再次或多次跳至铜栅上，受到电击后又迅速跳回平台，如此训练5 min。训练后24、48 h重复实验。记录小鼠第1次跳下平台的时间（即跳台潜伏期）和3 min内受到电击的次数（即错误次数）。若小鼠3 min未跳下平台，错误次数记为0次，潜伏期记为180 s。

2.5 统计学处理

计量资料用均数±标准差（±s）表示，用SPSS 17.0软件进行统计学处理，各组比较采用单因素方差分析及LSD检验。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 氯胺酮对幼龄小鼠自主活动的影响

在自主活动实验中，与A组比较，B组、E组、F组、H组小鼠自主活动次数均明显增加（P＜0.05或P＜0.01），与B组比较，C组、D组小鼠自主活动次数均明显减少（P＜0.05或P＜0.01）。各组小鼠自主活动实验结果见表1。

表1 各组小鼠自主活动实验结果（ ±s，n＝10）Tab1 Results of spontaneous motor activity test of mice in each grou（ ±s，n＝10）

表1 各组小鼠自主活动实验结果（ ±s，n＝10）Tab1 Results of spontaneous motor activity test of mice in each grou（ ±s，n＝10）

与A组比较：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与B组比较：#P＜0.05，##P＜0.01vs.groupA：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.group B：#P＜0.05，##P＜0.01

组别 自主活动次数19.4±14.5 47.5±20.3＊16.1±14.1#8.9±8.2##59.9±34.9＊＊64.0±55.9＊＊29.9±10.7 50.6±20.3＊ABCDEFGH

3.2 氯胺酮对幼龄小鼠的致遗忘作用

在避暗和跳台实验中，训练后24 h，与A组比较，B组、E组、F组小鼠的错误次数均明显增加，避暗潜伏期和跳台潜伏期均明显缩短（P＜0.05或P＜0.01），表明氯胺酮使小鼠产生了遗忘作用；与A组比较，C组、D组小鼠的错误次数、避暗潜伏期和跳台潜伏期均无明显差异（P＞0.05），表明单独使用0.10、0.20 mg/kg－1的Bic对小鼠学习记忆能力无明显影响；与B组比较，E组、F组小鼠的错误次数、避暗潜伏期和跳台潜伏期均无明显差异（P＞0.05），表明Bic未能拮抗氯胺酮所致的遗忘作用；与A组比较，G组小鼠的错误次数、避暗潜伏期和跳台潜伏期均无明显差异（P＞0.05），表明单独使用60 ng NMDA对小鼠学习记忆能力无明显影响；与B组比较，C组、D组、G组、H组小鼠的错误次数均明显减少，避暗潜伏期和跳台潜伏期均明显延长（P＜0.05），表明60 ng NMDA可拮抗氯胺酮所致的遗忘作用。训练后48 h，各组小鼠的错误次数、避暗潜伏期和跳台潜伏期间均无明显差异（P＞0.05）。各组小鼠避暗实验结果见表2，各组小鼠跳台实验结果见表3。

表2 各组小鼠避暗实验结果（ ±s，n＝10）Tab 2Results of step-through test of mice in each grou（±s，n＝10）

与A组比较：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与B组比较：#P＜0.05，##P＜0.01vs.groupA：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.group B：#P＜0.05，##P＜0.01

组别 训练后48 h ABCDEFGH避暗潜伏期，s 259±87 231±113 256±78 240±103 284±40 287±28 222±106 272±53训练后24 h错误次数0.5±0.5 2.2±1.5＊＊1.0±0.5#0.9±0.9#2.0±2.0＊＊1.6±1.3＊0.7±0.5##0.8±0.7##避暗潜伏期，s 212±110 60±38＊＊171±88#183±125##111±99＊92±87＊＊171±120#178±108#错误次数0.2±0.4 0.4±0.7 0.4±0.7 0.3±0.5 0.2±0.4 0.2±0.4 0.5±0.5 0.3±0.5

4 讨论

本实验结果表明，氯胺酮使幼龄小鼠自主活动次数增加，可能是增加了小鼠神经兴奋性。氯胺酮在用药后24 h内具有致遗忘作用，但48 h后该作用消失，可能是药物已被基本消除之故，提示单次使用氯胺酮并未对幼龄小鼠造成长期的神经损害。

跳台和避暗实验是常用的研究动物记忆的实验方法。笔者由预实验确定给药剂量，幼龄小鼠腹腔注射100 mg/kg氯胺酮，结果其错误次数明显增加，避暗潜伏期和跳台潜伏期均明显缩短，表明其对小鼠产生了明显的遗忘作用。

表3 各组小鼠跳台实验结果（±s，n＝10）Tab 3Results of step-down test of mice in each grou（±s，n＝10）

表3 各组小鼠跳台实验结果（±s，n＝10）Tab 3Results of step-down test of mice in each grou（±s，n＝10）

与A组比较：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与B组比较：#P＜0.05，##P＜0.01vs.groupA：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.group B：#P＜0.05，##P＜0.01

组别 训练后24 h 训练后48 h ABCDEFGH跳台潜伏期，s 272±55 242±94 227±79 226±73 206±89 210±92 202±84 215±98错误次数0.9±0.8 2.9±2.5＊1.0±1.1#1.1±1.0#2.7±2.5＊2.8±2.3＊1.4±1.2#0.9±1.0#跳台潜伏期，s 219±79 91±67＊＊192±111#198±97#104±82＊79±88＊＊191±88#188±98#错误次数0.4±0.7 0.6±0.8 1.1±0.4 1.4±1.4 1.4±1.1 1.4±1.7 1.3±1.2 1.1±1.5

目前普遍认为，GABA是中枢神经系统的主要抑制性递质，目前已知其受体有3种类型：GABAA、GABAB、GABAC，其中GABAA受体是全身麻醉药作用的重要靶位[5]。Bic是GABAA受体特异性阻滞药。预实验中发现，当侧脑室注射Bic 0.25 mg/kg时，部分小鼠出现惊厥、抽搐。因此本研究以0.20 mg/kg为最高剂量，等比选择0.10、0.20 mg/kg 2个剂量。结果显示，上述剂量下，Bic并未明显改变小鼠的错误次数、避暗潜伏期和跳台潜伏期，提示GABAA受体并非氯胺酮引起遗忘作用的重要靶位。

谷氨酸是中枢神经系统的主要兴奋性递质，谷氨酸受体分为两大类：离子型受体和代谢型受体。其中NMDA受体是一种离子型受体，广泛分布于海马、皮层等与记忆密切相关的脑区，在记忆和长时程增强（Long-term potentiation，LTP）形成过程中发挥着重要作用。氯胺酮能阻断各种刺激后产生的LTP效应，从而干扰学习记忆过程[9]。NMDA是NMDA受体的特异性激动药。预实验中发现，当侧脑室注射75 ng NMDA时，部分小鼠出现过度兴奋、惊厥，90 ng则可引起小鼠死亡。故选用60 ng的剂量。结果显示，在避暗和跳台实验中，与A组比较，G组小鼠的错误次数、避暗潜伏期和跳台潜伏期均无明显差异。与B组比较，H组小鼠的错误次数明显减少，避暗潜伏期和跳台潜伏期均明显延长，提示NMDA能改善氯胺酮所致的遗忘作用。

综上所述，在本实验条件下，氯胺酮可致幼年小鼠自主活动次数增多且有显著致遗忘作用；NMDA受体是氯胺酮致遗忘作用的重要靶位，而GABAA受体则不是。

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