高温胁迫诱导龙牙楤木次生体胚发生过程中抗氧化酶活性变化1)

赵晓妮 孙凤阳 尹 静 由香玲

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

龙牙楤木(Aralia elata(Miq.)Seem.)，又名辽东楤木、刺老芽等，属五加科楤木属(Aralia L.)植物［1］，为重要的食、药兼用的植物。其嫩芽含有人体必需的多种氨基酸和微量元素［2］，根皮和树皮性味辛苦，有小毒，具有补气安神、强精滋肾、祛风活血、除湿止痛的功效［3］。近年来的研究显示龙牙楤木皂苷在免疫调节、肿瘤防治方面有很显著的作用［4］。但是，龙牙楤木的野生资源由于破坏性、掠夺性地进行连年多茬采收，其资源量急剧下降，黑龙江省已将其列为濒危珍稀植物，其高效繁殖也显得尤为重要而迫切。

体胚发生方式是一种高效快繁方法。关于龙牙楤木体胚发生的研究报道已有不少，例如:Amemiya et al.［5］利用10年生龙牙楤木树上的冬芽在含有2，4－D 的 MS 培养基中诱导产生了体胚;Kang et al.［6］在含2，4－D的培养基中，从龙牙楤木毛状根中诱导了体胚;Dai et al.［7］利用IBA诱导了体细胞胚发生等。现报道的研究主要是外植体选择和利用植物生长调节剂建立体胚快速繁殖体系。在本研究过程中发现，高温胁迫能够诱导龙牙楤木次生体胚发生。高温诱导体胚发生的实例有胡萝卜和油菜，其中，37℃高温处理胡萝卜的顶芽后转入无任何植物生长调节剂培养基中诱导了体胚发生［8］;油菜花芽内小孢子经高温处理后，诱导了前期体胚［9］。但研究者们未深入分析其中的原因，仅从体胚发生角度研究了这种诱导体胚发生的方法。事实上，高温胁迫会使外植体各种生理状态发生变化，其中一项重要的生理变化是抗氧化酶的变化。因为胁迫产生了大量的活性氧，可使细胞膜脂过氧化而伤害细胞［10］。文中详细介绍了37℃高温诱导次生体胚的过程，为高效快速繁殖龙牙楤木提供更简便快捷的方法;同时考察了高温处理过程中及次生体胚发生过程中3种抗氧化物酶(SOD、POD、CAT)活性的变化特征，从生理活性角度揭示了高温胁迫处理对体胚诱导的作用。

1 材料与方法

次生体胚诱导:本试验在先前的研究中，通过无菌实生苗根诱导(在1/2SH+2.0 mg·L－1IBA+20 g·L－1蔗糖的固体培养条件下)获得了大量龙牙楤木成熟子叶体胚［7］。从中选取1.5 cm长的成熟子叶体胚，接种于不含有任何植物生长调节剂，添加20 g·L－1蔗糖的WPM固体培养基中，置于培养箱中37℃培养0～3 d，取出放置于培养室进行暗培养诱导次生体胚。每个培养瓶中接种8个体细胞胚，每个处理接种10瓶。每次取0.2 g，每隔5 d取样1次，共取5次，迅速放入冰箱－40℃保存，留作抗氧化酶活性分析。上述培养基均添加3 g·L－1水晶洋菜(gelrite，Duchefa－Postubus Haarlem，Netherlands)，pH 值为5.8，经过高温高压灭菌(121 ℃、0.152 MPa、15 min)后使用。材料在常规组织培养室中培养(温度(23±1)℃，暗培养，湿度60% ～70%)。

SOD、POD、CAT活性测定:将龙牙楤木体胚材料置于预冷的研钵中，加1.0 mL预冷的0.05 mol·L－1磷酸缓冲液(pH值为7.8)在冰浴上研磨成浆后，转入离心管中加0.05 mol·L－1磷酸缓冲液(pH值为7.8)使终体积为 5.0 mL。然后在 4 ℃、10 000 r·min－1离心15 min，取上清液作为粗酶液于冰箱中4℃冷藏，用于测定超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶活性分析。

超氧化物歧化酶(SOD)活性采用NBT光还原法测定［11］;过氧化物酶(POD)活性采用0.3%愈创木酚法［11］测定;过氧化氢酶(CAT)活性采用240 nm比色法［11］测定。

数据分析:数据采用Excel 2003进行整理及作图处理，应用SPSS19.0软件进行Tukey多重比较分析和相关性分析，所得数据均为3次的平均值。

2 结果与分析

2.1 高温胁迫诱导龙牙楤木次生体细胞胚发生

龙牙楤木成熟体细胞胚在恒温培养箱中37℃处理0～3 d，接种于无任何植物生长调节剂的WPM培养基中培养21 d，都有次生体细胞胚发生(图1A、B、C)。观察发现，在此过程中10～15 d是次生体细胞胚发生的时期，此后20～25 d基本是体细胞胚发育成长的时期。与未进行高温处理的对照和处理1 d的外植体相比，高温处理3 d的外植体材料变褐，且平均每个体胚上产生次生体细胞胚的数量较少，约2个(表1)。统计次生体胚的诱导情况(表1)显示，高温处理外植体1 d，次生体胚的诱导情况较好，诱导率和体胚诱导数量分别为58%和4个，显著高于对照(P＜0.05);但是随着高温处理时间的延长，体胚的诱导率逐渐下降，均显著低于对照(P＜0.05)，而且高温处理3d的体胚诱导率略低于处理2 d的，无显著差异(P＞0.05)。结果表明，合适的高温胁迫有利于次生体胚发生。

图1 成熟体胚经高温处理后在无任何植物生长调节剂的WPM培养基中诱导的次生体胚

表1 高温处理0～3 d的体细胞胚在无任何植物生长调节剂的培养基中诱导次生体细胞胚的情况

2.2 高温胁迫诱导龙牙楤木次生体胚发生过程中抗氧化酶活性分析

2.2.1 高温胁迫处理及次生体胚发生过程中SOD活性变化

经高温处理1～3 d的龙牙楤木体胚与未处理的相比，SOD活性都有所升高，但是升高幅度不大(取材时间为0 d)(表2)。在体细胞胚发生过程中，与对照相比，在第5 d SOD活性都有所下降，到第10 d时，SOD活性达到最高峰，之后各处理的SOD活性呈下降趋势。第10～15 d是胚性细胞形成时期。在第5～10 d，未处理材料中的SOD活性都高于处理的;而在第15 d处理材料的SOD活性都高于未处理的。且整个次生体胚发生过程中，处理1 d外植体中SOD的活性均较高。

2.2.2 高温胁迫处理及次生体胚发生过程中POD活性变化

龙牙楤木体胚经高温处理后，与对照相比，各个处理的POD活性均下降(取材时间为0～5 d)(表2)。处理后在次生体胚发生过程中，胚性细胞的形成时期，即第10 d POD活性迅速上升至最高，而且高温处理1 d的POD活性最高，随后其活性下降，且活性基本不变。表明POD活性升高可促进次生体胚发生和胚性细胞的早期发育，而高温胁迫1 d更利于体胚发生的形成。

表2 高温胁迫处理及次生体胚发生过程中SOD、POD、CAT活性变化

2.2.3 高温胁迫处理及次生体胚发生过程中CAT活性变化

龙牙楤木体胚经高温处理后，与对照相比，各处理的CAT活性均呈下降趋势(取材时间为0 d)(表2)。在次生体胚发生过程中，CAT活性逐渐升高，在第15 d CAT活性达到最高，而后其活性虽有小幅下降，但维持在一个较高的水平。高温处理1 d外植体的CAT活性相对其他处理的较高，而且在次生胚性细胞形成期第15 d活性达到最高，其后维持在较高水平。由此可知次生体胚的发生发育过程中，CAT活性均升高。崔凯荣等［12］在研究枸杞的体胚发生过程中发现，CAT在继代愈伤组织中的活性很高，随着胚性细胞的形成酶活性降低，到分化培养3 d时出现酶活性的低谷，随着胚性细胞的分裂、发育，这种酶活性又开始逐渐升高，成熟胚期活性升到和继代愈伤组织大致相同水平。而与本研究体胚发生过程不太一致。可能由于本研究外植体材料预先进行的高温胁迫改变了其变化趋势。

通过对高温胁迫处理后龙牙楤木体胚SOD、POD、CAT活性的变化进行Pearson相关性分析，得出POD与CAT活性之间的相关系数r=0.983，P=0.017＜0.05，表明两者呈显著正相关，且龙牙楤木体胚随着高温胁迫处理时间的延长，POD与CAT活性都显著低于对照组(P＜0.05)，龙牙楤木体胚的POD与CAT完全失去保护作用;而SOD与POD、CAT活性呈一定的负相关，但不显著(P＞0.05)，龙牙楤木体胚随着高温胁迫处理时间的延长，SOD活性略高于对照组，差异不显著(P＞0.05)，表明高温胁迫处理后龙牙楤木体胚中SOD可能对其活性氧的清除起到关键作用;在龙牙楤木次生体胚发生过程中3种抗氧化酶活性之间相关性不显著。

3 结论与讨论

植物体在遭受高温胁迫后，细胞内将积累大量的活性氧［13－15］，诱使细胞内合成表达抗氧化酶类以消除或缓解活性氧对细胞的毒害作用。作为内源性保护酶，SOD负责催化·转变为H2O2，并在过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)的作用下将其分解为H2O和O2，消除高温胁迫产生的活性氧对细胞的伤害［16］。本研究发现，高温胁迫龙牙楤木体胚诱导次生体胚发生过程中，3种抗氧化酶活性均有明显变化。高温胁迫均使POD和CAT活性降低，而SOD活性则升高。在次生体胚发生过程中，3种过氧化物酶活性均有显著的变化。在胚性细胞分化的早期(第10、15 d)，处理外植体的POD、SOD活性相对较高，CAT活性较低。在体胚发育过程中(第15 d以后)，SOD和POD活性都呈显著下降趋势(P＜0.05)，而CAT活性维持在较高的水平。由此可推测，SOD和POD对次生体胚诱导起主导作用，而CAT对体胚的发育和成熟起关键作用。本试验结果同时也表明，在次生体胚发生过程中，3种抗氧化物酶(SOD、POD、CAT)相互配合来调节胚性细胞的发生与发育过程，与陈义挺等［17］对龙眼体胚发生早期POD活性研究结果一致。处理1d外植体为合适的处理，其活性均高于其他处理，而其次生体胚诱导率相对较高。3种过氧化物酶活性的规律性变化，可能是在不同的细胞器中进行，从而使体胚发生过程氧化系统维持在一个适宜的水平，以消除高温对体胚发生的影响。在花楸体胚发生过程中，研究者发现，SOD、POD活性均在胚性细胞向球形胚转化时下降，球形胚向心形胚发育时下降，心形胚向鱼雷形胚和鱼雷形胚向子叶形胚发育时再升高;CAT活性变化规律与SOD、POD活性变化不同［18］，这可能是不同材料的体胚发生过程中抗氧化系统的协调方式不同所致。

许多资料显示，一定浓度的H2O2对体胚产生有促进作用。枸杞体胚发生的研究发现，适量浓度的H2O2对枸杞胚性细胞的形成和体细胞胚的发育有促进作用;过高的H2O2则有抑制作用［19］。本研究的高温胁迫，同样也产生了大量活性氧。H2O2作为一种细胞信号传递物质，可以通过细胞的信号传递系统影响基因的调控表达。胚性细胞的形成过程，即细胞的分化过程，其核心是基因的差异表达，H2O2可能在分子水平上诱导胚胎的发生［12］。

崔凯荣等［12］在枸杞的体胚发生过程中发现，在胚性愈伤组织转入分化培养基后，随着胚性细胞的形成，SOD活性逐渐升高，当胚性细胞进一步分裂形成体细胞胚时，SOD活性达到最高峰，表明SOD活性升高对胚性细胞的分化及胚胎发育具有促进作用。原海云等［20］以连翘为试验材料，研究高温胁迫对连翘细胞SOD活性的影响发现，在12～24 h，高温胁迫时间与连翘细胞SOD活性呈正相关，这与本试验结果相一致。根据本试验3种抗氧化物酶的相关分析表明，POD与CAT活性呈显著正相关(r=0.983)，POD、CAT活性能够准确地反映高温胁迫龙牙楤木体胚发生随处理时间的变化趋势，这对研究龙牙楤木次生体胚的发生具有一定的指导意义。

［1］ 孙涛，张国荣，王彦，等.龙牙楤木的化学成分、药理作用和食用价值研究进展［J］.人参研究，2009(1):24－25.

［2］ 吴立东，赵凤珍.刺嫩芽资源的经营利用［J］.林业勘查设计，2004(2):53.

［3］ 张淑慧，陈静，赵智勇，等.龙牙楤木的研究概况［J］.黑龙江医药，2001，14(4):291－292.

［4］ Yagi-Chaves S N，Liu Gang，Yamashita K，et al.Effect of five triterpenoid compounds isolated from root bark of Aralia elata on stimulus-induced superoxide generation，tyrosyl or serine/threonine phosphorylation and translocation of p47(phox)，p67(phox)，and rac to cell membrane in human neutrophils［J］.Archives of Biochemistry and Biophysics，2006，446(1):84－90.

［5］ Amemiya K，Mochizuki T.Somatic embryoformation and plant regeneration in‘Zaoh’line No.2 of Japanese angelica tree(Aralia elata Seem.)［J］.Plant Biotechnology，2002，19(5):383－387.

［6］ Kang H J，Anbazhagan V R，You Xiangling，et al.Production of transgenic Aralia elata regenerated from Agrobacterium rhizogenesmediated transformed roots［J］.Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2006，85(2):187－196.

［7］ Dai Jinling，Tan Xiao，Zhan Yaguang，et al.Rapid and repetitive plant regeneration of Aralia elata Seem.via somatic embryogenesis［J］.Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2011，104(1):125－130.

［8］ Kamada H，Kobayashi K，Kiyosue T，et al.Stress induced somatic embryogenesis in carrot and its application to synthetic seed production［J］.In Vitro Cellular ＆ Developmental Biology-Plant，1989，25(12):1163－1166.

［9］ Pechan P M.Successful cocultivation of Brassica napus microspores and proembryos with Agrobacterium［J］.Plant Cell Reports，1989，8(7):387－390.

［10］ 尚庆茂，陈淑芳，张志刚.硒对高温胁迫下辣椒叶片抗氧化酶活性的调节作用［J］.园艺学报，2005，32(1):35－38.

［11］ Havir E A，McHale N A.Biochemical and developmental characterization of multiple forms of catalase in tobacco leaves［J］.Plant Physiology，1987，84(2):450.

［12］ 崔凯荣，任红旭.枸杞组织培养中抗氧化酶活性与体细胞胚发生相关性的研究［J］.兰州大学学报:自然科学版，1998，34(3):93－99.

［13］ 梁雪，颜坤，梁燕，等.高温对耐热大葱品种PSⅡ和抗氧化酶活性的影响［J］.园艺学报，2012，39(1):175－181.

［14］ 卢琼琼，宋新山，严登华.高温胁迫对大豆幼苗生理特性的影响［J］.河南师范大学学报:自然科学版，2012，40(1):112－115.

［15］ 邓茳明，熊格生，袁小玲，等.棉花不同耐高温品系的SOD，POD，CAT活性和MDA含量差异及其对盛花期高温胁迫的响应［J］.棉花学报，2010，22(3):242－247.

［16］ Alscher R G，donahue J L，Cramer C L.Reactive oxygen species and antioxidants:relationships in green cells［J］.Physiologia Plantarum，1997，100(2):224－233.

［17］ 陈义挺，赖钟雄，林玉玲，等.温度对龙眼体胚发生早期POD活性及同工酶的影响［J］.中国农学通报，2009，25(9):32－37.

［18］ 张建瑛，杨玲，沈海龙.花楸体细胞胚发生过程中抗氧化酶活性的变化［J］.植物生理学通讯，2007，43(2):264－268.

［19］ Kairong C，Gengsheng X，Xinmin L，et al.Effect of hydrogen peroxide on somatic embryogenesis of Lycium barbarum L.［J］.Plant Science，1999，146(1):9－16.

［20］ 原海云，姚延梼.高温胁迫对连翘叶片SOD活性的影响［J］.天津农业科学，2011，17(6):102－104.