高效液相色谱法测定养殖环境中甲基睾丸酮残留量

邓建朝，李来好，杨贤庆*，岑剑伟，吴燕燕，陈胜军，戚 勃

(中国水产科学研究院南海水产研究所，农业部水产品加工重点实验室，国家水产品加工技术研发中心，广东 广州 510300)

甲基睾丸酮(17α-methyltestosterone，17α-MeT)又名甲睾酮，甲基睾酮，甲基睾丸素。分子式为C20H30O2，相对分子质量为302.45，不溶于水，易溶于有机溶剂，是一种人工合成的蛋白同化激素。在水产养殖中，甲基睾丸酮作为性别诱导制剂，鱼苗期性别分化前投喂，可以诱导性逆转得到单雄性，显著提高渔业产量[1-3]。作为一种激素，研究表明极小的残留即能危害人体健康，如干扰人体内激素的平衡，引起妇女出现类似早孕的反应及乳房胀、不规则出血等，影响肝脏功能，致新生儿畸形、溶血及黄疸等一系列副作用。鉴于甲基睾丸酮存在潜在的危害，包括我国在内的许多国家都将其列为水产养殖中的禁用药物。

目前甲基睾丸酮的检测方法较多，主要有酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)法[4]、气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)法[5-7]、液相色谱-质谱联用(high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS)法[8-10]、毛细管电泳(capillary electrophoresis，C E)法[11]、化学发光法[12]和高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)法[13-15]。其中，酶联免疫法作为一种生化检测方法广泛用于实际样品检测，其灵敏度高、特异性强、方便快捷，但存在假阳性问题；GC-MS法检测限低，灵敏度高，但需将样品经过复杂的衍生化步骤后才能测定，导致前处理过程比较复杂，不适合大批量样品的检测；HPLC-MS法虽然灵敏度和特异性很高，但仪器昂贵，对操作人员要求较高，普及性较差；毛细管电泳法和化学发光法对操作人员要求较高，样品前处理复杂，很难在实验室普及应用。对于一些曾经使用过甲基睾丸酮的池塘，长时期残留在水体及底泥中的药物会对后续养殖的水产动物造成二次污染，因此，有必要对养殖环境中的甲基睾丸酮进行监测评估。而至今养殖水体及底泥环境中的基睾丸酮的检测方法尚未见有相关报道。本研究建立一套利用高效液相色谱检测养殖池塘水体和底泥中甲基睾丸酮的方法，旨在为研究甲基睾丸酮代谢规律及监测养殖环境中甲基睾丸酮的残留提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验材料采自中山市罗非鱼规模化养殖场养殖鱼池的水体和底泥。甲基睾丸酮标准品(纯度≥98%) 德国Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司；甲醇(色谱纯) 美国Sigma-Aldrich公司；甲醇、乙腈、乙醚、二氯甲烷和冰乙酸等(均为分析纯) 广州化学试剂厂；实验用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

1100高效液相色谱仪[配有二极管阵列检测器(diode array detector，DAD)] 美国Agilent公司；旋转蒸发仪 日本Eyela公司；MMV-1000W萃取振荡仪 日本东京理化器械株式会社；TDZ5-WS低速离心机 长沙湘智离心机仪器有限公司；XW-80A微型旋涡混合仪 上海沪西分析仪器厂；GB204型电子分析天平 瑞士Mettler Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Agilent C18柱(250mm×4.6mm(i.d.)，5μm)；流动相：甲醇-0.5%乙酸(77：23，V/V)；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：20μL；检测波长：245nm。

1.3.2 标准溶液的配制

200μg/mL甲基睾丸酮标准储备液：准确称取10.0mg 甲基睾丸酮，用甲醇溶解，定容于50mL容量瓶中，于0～4℃避光存放；甲基睾丸酮标准工作液：准确吸取适量甲基睾丸酮标准储备液，根据需要用甲醇配制成适当质量浓度的标准工作液。

1.3.3 水体样品前处理

先将水样用0.45μm膜过滤，除去固体杂质。准确移取100mL水样于250mL分液漏斗，加入30mL二氯甲烷，振摇5min，静置，将二氯甲烷层移至100mL的梨形瓶。向分液漏斗再加入30mL二氯甲烷重复上述步骤一次，静置分层后，将二氯甲烷层并入同一梨形瓶，于45℃条件下减压蒸发至近干。残留物用1.0mL甲醇溶解，取溶解液过0.45μm微孔滤膜，供液相色谱测定。

1.3.4 底泥样品前处理

称取10.0g试样于100mL聚丙烯离心管中，加入20mL甲醇，加塞剧烈振荡提取10min，以4000r/min离心10min，将上清液移至鸡心瓶中，向原离心管中加入20mL甲醇，重复上述步骤一次，合并提取液于梨形瓶中。在45℃水浴条件下减压蒸发至近干，残留物用1.0mL甲醇溶解，过0.45μm微孔滤膜，供液相色谱测定。

1.3.5 计算公式

水体中甲基睾丸酮的含量按公式(1)计算。

式中：cx为试样中甲基睾丸酮含量/(μg/L)；cs为标准溶液中甲基睾丸酮含量/(μg/mL)；A为试液峰面积响应值；As为标准溶液峰面积响应值；V为试液定容体积/mL；V0为试样体积/mL。

底泥中甲基睾丸酮的含量按公式(2)计算。

式中：cx为试样中甲基睾丸酮含量/(μg/kg)；cs为标准溶液中甲基睾丸酮含量/(μg/mL)；A为试液峰面积响应值；V为试液定容体积/mL；As为标准溶液峰面积响应值；m为试样质量/g；W为含水率/%。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 流动相的选择

流动相优化过程中，以甲醇为有机相，分别选择水、0.5%乙酸溶液、50mmol/L乙酸铵溶液(pH4.5)作为水相，比较分离效果。结果表明，水相为0.5%乙酸和50mmol/L乙酸铵(pH4.5)时，能够减少峰形拖尾，鉴于盐溶液会影响分离柱的使用寿命，本实验选用0.5%的乙酸作为水相。由于底泥样品中成分复杂，甲醇提取液中杂质较多，如果甲醇在流动相中所占体积过大，样品中杂质峰对目标物干扰严重，综合考虑，采用甲醇-0.5%乙酸体积比为77：23时，峰型较好，目标峰和杂质峰能够完全分离。

2.1.2 取样量和进样量的选择

由于甲基睾丸酮在水体中残留较少，试样提取时，取样量过小则不利于监控，取样量过大又造成操作上的困难，最后取样量选择100mL。底泥本身含杂质成分较多，取样量过大，杂质的干扰变大，最后选择10g作为土样的取样量。由于提高色谱进样量可以降低实际样品检测限，比较了进样量为10、20、30、40μL和50μL条件下甲基睾丸酮的分离情况。结果表明，随着进样量的增大，目标峰的峰宽变宽，峰高变低，加大了样品中杂质的干扰。进样量太小，不利于实际试样的测定，综合考虑以上因素，进样量选用20μL。

2.1.3 检测波长的选择

图 1 甲基睾丸酮标准溶液色谱图Fig.1 Chromatogram of 17α-Met standard solution

图 2 水体中甲基睾丸酮加标色谱图Fig.2 Chromatograms of blank water with and without spiked 17α-MeT (5 μg/L)

图 3 底泥中甲基睾丸酮加标色谱图Fig.3 Chromatograms of blank sediment with and without spiked 17α-MeT (5 μg/L)

取某一浓度甲基睾丸酮标准品，用液相自带光电二极管阵列检测器从190～400nm波长处进行扫描，结果显示甲基睾丸酮的最大吸收波长在245nm处。因此，检测波长选择245nm。

在优化的色谱条件下，甲基睾丸酮标准品典型色谱图见图1，相对保留时间约为7.9min，峰形尖锐，对称。加标池塘水体和底泥色谱图见图2、3。

2.2 提取溶剂的选择

根据甲基睾丸酮的性质及环境样品的特点，水体中的甲基睾丸酮残留可以通过二氯甲烷进行液-液萃取。底泥中的甲基睾丸酮分别采用甲醇、乙腈、乙醚、二氯甲烷等作为提取溶剂进行对比实验。当底泥加标质量浓度为50.0μg/kg时，甲醇、乙腈、乙醚作为提取溶剂对底泥中甲基睾丸的提取率分别为97.6%、101%和93.7%。结果表明，除二氯甲烷，几种有机溶剂对甲基睾丸酮的提取率均较高。二氯甲烷可使底泥严重变性，凝成一团，将底泥中有机胶体(腐殖质)中的杂质提取出来，悬浮于溶液中，给后期处理和测定造成很大麻烦。底泥本身含有一定量水，采用乙醚提取后，经过离心，乙醚和水相分层，也增加了后期处理的难度。相比之下，甲醇和乙腈的提取效果最好，从环保和经济性考虑，最后选用甲醇作为提取溶剂。

2.3 线性关系与检测限

用甲醇配制质量浓度依次为0.0500、0.100、0.500、1.00、10.0μg/mL和50.0μg/mL的甲基睾丸酮标准溶液，测定其峰面积相应值，以峰面积对应的质量浓度做工作曲线。当进样量为20μL时，甲基睾丸酮在质量浓度为0.0500～50.0μg/mL的范围内呈良好的线性关系，线性方程为Y=43.61X－0.3601，r=0.9999；在本法测定条件下，按信噪比RSN=3所对应的质量浓度为依据计算检出限，水体中甲基睾丸酮的检测限为0.5μg/L，底泥中甲基睾丸酮的检测限5.0μg/kg。

2.4 回收率与精密度

表1 水体加标回收率和相对标准偏差(n=5)Table 1 Recovery rates and relative standard deviations of 17α-MeT in spiked water at three levels (n=5)

将已知质量浓度的甲基睾丸酮标准溶液加入所采集水体和底泥中，使水体加标质量浓度分别为1.00、5.00、25.0μg/L，每个平行设一个空白对照，每个质量浓度做5个平行样品；使底泥加标量为10.0、50.0、250μg/kg，每个平行设一个空白对照，每个质量浓度做5个平行样品。加标后充分混匀，静置30min，按1.3.3节进行样品前处理，计算回收率和精密度。

表2 底泥加标回收率和相对标准偏差(n=5)Table 2 Recovery rates and relative standard deviations of 17α-MeT in spiked sediment at three levels (n=5)

由表1、2 可见，水体中方法的加标回收率在93.3%～101%，其相对标准偏差为3.0%～5.5%；底泥中方法的加标回收率在88.7%～96.6%，其相对标准偏差为2.7%～6.2%，说明方法的准确度和精密度良好。

3 结 论

本实验建立的养殖环境水体和底泥中甲基睾丸酮残留高效液相色谱测定方法中，甲基睾丸酮在水体和底泥中检测限分别为0.5μg/L和5.0μg/kg。在本实验条件下，被测样品的各组分与样品基质均实现较好分离，出峰时间合适，检测灵敏度较高。结果表明，采用本方法测定养殖水体和底泥中的甲基睾丸酮，操作简便、快速，适合于大批量样品的处理和检测，准确度和精密度较高，并具有很高的可靠性和实用性，适合在养殖环境监测中推广使用。

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