高产二十二碳六烯酸隐甲藻的选育及其发酵条件研究

孙中贯，刘 咏*，姚建铭，李 俊，朱素梅

(1.合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009；2.枣庄学院生命科学学院，山东 枣庄 277160；3.中国科学院等离子体物理研究所，安徽 合肥 230031；4.安徽科聚环保新能源有限公司，安徽 合肥 230031)

二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)，俗称脑黄金，是一种对人体非常重要的多不饱和脂肪酸(PUFA)，属于Omega-3不饱和脂肪酸家族中的重要成员，是动物和人体不能自身合成，必须从外界摄入的一类必需脂肪酸[1]。DHA对于神经系统有重要的功能，具有健脑、提高记忆力和视力的作用，尤其可以促进胎儿脑细胞发育和婴幼儿脑细胞生长，防治老年性痴呆及动脉粥样硬化、脑血栓等心脑血管疾病，受到食品界和医疗界的广泛关注[2]。目前，DHA作为营养补充剂，已被运用到乳制品、食用油、藻油软胶囊、DHA冲剂等食品和营养品中。

利用隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)ATCC30556发酵生产DHA具有发酵周期短、培养方式简单、产品质量稳定等优点，同时克服了传统的从鱼油中获取DHA受原料、气候、产地、生产周期等诸多限制因素的影响[3-4]。但原始藻种DHA产量较低，满足不了工业化生产的要求。为了进一步提高隐甲藻发酵生产DHA的能力，近年来国内外的专家学者做了大量的研究。Wang Jufang等[5]对隐甲藻ATCC30556发酵生产DHA的氮源进行优化，经优化后生物量及DHA的产量分别达到了2.98g/L、527.97mg/L。Jiang Yue等[6]研究温度对隐甲藻ATCC30556发酵的影响，发现将藻种先在25℃培养48h，然后在15℃继续培养24h，DHA的产率最高为1.47mg/(L·h)。任路静等[7]采用流加策略实现了隐甲藻ATCC30556生产DHA的高密度发酵。采用5d连续发酵多次流加策略，发酵结束后DHA含量仅为0.0641g/g干物质。荣辉等[8]利用紫外线对隐甲藻ATCC30556进行诱变处理，得到的目的藻株DHA含量与出发藻株相比仅提高了28.39%。但目前，利用隐甲藻ATCC30556发酵生产DHA的研究仍处于实验室阶段，且使用的藻种DHA含量普遍较低。本实验拟通过对超诱变剂亚硝基胍诱变及诱变后的发酵条件控制，旨在获得DHA含量高的优良藻株，并确定诱变后隐甲藻的最佳发酵条件。

1 材料与方法

1.1 菌种

隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)ATCC30556，由武汉嘉吉烯王生物工程有限公司提供。

1.2 培养基

种子培养基：葡萄糖10g/L、酵母膏3g/L、海盐16g/L；发酵培养基：葡萄糖30g/L、酵母膏6g/L、海盐16g/L、MgSO4·7H2O 5.0g/L、KH2PO40.1g/L、KNO35g/L、VB16mg/L、VB121μg/L，采用蒸馏水定容，调整pH值为7.0。

1.3 仪器与设备

722s可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；DZF-6030B真空干燥箱 东莞市豪邦工业设备有限公司；GC-14C气相色谱仪(配有氢火焰离子化检测器(FID)和N2000色谱工作站) 日本岛津公司。

1.4 菌种培养方法

液体种子培养：25℃、100r/min振荡培养72h；摇瓶发酵培养：500mL三角瓶，装液量10%，接种量10%，在25℃、120r/min条件下振荡培养240h。

1.5 诱变方法

取对数期生长的藻液分装入10mL离心管中，每管1mL。加入亚硝基胍溶液[9]，使其最终质量浓度依次为250、200、150、100、50、0μg/mL，室温下处理30min后离心收集藻细胞，然后用磷酸缓冲液反复清洗3次，以除去诱变剂[10-12]。加入5mL无菌人工海水进行稀释后，取1mL接种于100mL三角瓶中，三角瓶装液量为10mL，置于往复式摇床100r/min，25℃培养，培养5d后经细胞计数测定各组的致死率。

1.6 筛选方法

大量研究[13]表明，致死率为80%左右的诱变处理有利于正突变的产生。选择此致死率条件下诱变处理后培养的藻液进行分瓶培养，30℃培养72h后取样测定培养液OD520nm值。根据测定结果选择OD520nm值较大的培养液作为种子液，进行下一轮的分瓶培养，如此反复直至测定的培养液的OD520nm值无显著差异为止。以此培养液为种子液进行发酵实验，以藻株的发酵生物量、总油脂产量及DHA产量为筛选指标，筛选出较出发藻株更优良的突变株。

1.7 分析方法

1.7.1 细胞计数取1mL藻液，加入5%冰醋酸，杀死藻细胞，于显微镜下用血球计数板计数。

1.7.2 致死率测定

参照Cafiavate等[14]的方法，将经过诱变处理培养5d后的藻细胞用血球计数板测定细胞密度。根据回归方程Y=aXb(其中Y为培养5d后的藻细胞密度，X为藻细胞的初始密度，此方程由设置不同初始密度的藻液培养5d后测定藻细胞密度，根据两者数据拟合所得)推算上述诱变处理后的活细胞密度。每个诱变处理浓度随机测3个样，取平均值，计算致死率并绘制致死曲线。

式中：X1为未诱变处理的对照藻细胞密度/(个/L)；X2为诱变处理后的藻细胞密度/(个/L)。

1.7.3 生物量的测定取50mL样液装入预先称质量的离心管中，4000r/min 离心5min，沉淀用蒸馏水洗涤3次，50℃真空干燥，在干燥器内冷却后称质量，直至恒质量。

1.7.4 油脂提取

采用Soxhlet法[15]提取菌体中的总油脂。

1.7.5 油脂处理

取50mg油脂，加入1mg十七烷酸，置于100mL的磨口烧瓶中，加入0.5mol/L氢氧化钾的甲醇溶液2mL，于60℃水浴30min进行皂化，冷却后加入2mL三氟化硼-乙醚(体积比为1：1)溶液，60℃水浴10min，冷却后加入5mL正己烷振荡，然后加入5mL饱和食盐水，静置分层后取上层正己烷相，抽取上层可直接进样。

1.7.6 脂肪酸检测

气相色谱法，色谱条件为：毛细管色谱柱DB-23 (30m×0.32mm)，载气为氮气。内标法定量，内标物为十七烷酸。采用程序升温，140℃保持3min，10℃/min升温，升温至250℃，保持15min。

1.8 高产藻株遗传稳定性测定

对挑选出的藻种连续传代5次，分别进行发酵实验，检测发酵生物量、总油脂产量及DHA的含量。

1.9 培养条件对目的藻株发酵的影响

1.9.1 起始pH值对目的藻株发酵的影响

配制不同pH值(5.5、6.0、6.5、7.0、7.5)的发酵培养基，作为起始培养pH值。在25℃、120r/min条件下振荡培养240h。比较起始pH值对发酵生物量、总油脂产量及DHA含量的影响。

1.9.2 培养温度对目的藻株发酵的影响

将接种的液体发酵培养基置于22、24、26、28、30℃环境中培养，在pH6.5、120r/min条件下振荡培养240h。比较温度对发酵生物量、总油脂产量及DHA含量的影响。

1.9.3 摇床转速对目的藻株发酵的影响

在pH6.5、26℃条件下振荡培养240h，调节摇床的转速分别为100、120、150、180r/min。比较摇床转速对发酵生物量、总油脂产量及DHA含量的影响。

1.9.4 培养时间对目的藻株发酵的影响

在pH6.5、26℃、120r/min的条件下，进行摇瓶发酵实验。从发酵72h开始，每隔48h测定一次发酵生物量、总油脂含量及DHA产量，直至264h发酵结束。比较不同发酵时间发酵生物量、总油脂产量及DHA含量的变化。

2 结果与分析

2.1 致死率的测定结果

采用上述诱变方法对隐甲藻ATCC30556进行诱变处理，根据回归方程Y=aXb推算处理后存活的藻细胞密度计算亚硝基胍对藻细胞的致死率，结果如图1所示。

图 1 亚硝基胍致死曲线Fig.1 Lethal curve of NTG

由图1可知，亚硝基胍的质量浓度在0～50μg/mL时，藻细胞死亡率逐渐上升至40%，当质量浓度超过50μg/mL时，曲线斜率增加明显，诱变剂量与藻细胞死亡率几乎呈线性关系。说明该藻株对质量浓度超过50μg/mL的亚硝基胍溶液较敏感，当诱变剂量由150μg/mL增至250μg/mL时，曲线斜率反而有所下降，说明该藻株对较高质量浓度的亚硝基胍溶液有一定的抵抗能力。致死率高于90%的诱变剂量会对藻细胞造成较大影响，导致藻株活力下降生长速度变慢，且负突变出现几率较大，而采用低诱变剂量时，藻细胞对诱变作用敏感性较低，突变株性状不稳定。因此，利用诱变剂进行目标性状的诱变育种时，选择合适的诱变剂量是实验成败的关键。大量研究表明，致死率为80%左右的诱变剂量有利于正突变的产生，且在此致死率下对藻株的比生长速率影响不大。因此根据致死曲线，综合考虑实验的诸多因素，选择致死率为79.4%的诱变剂量150μg/mL。

2.2 突变藻株的获得

对出发藻株进行上述诱变处理，共筛选出4株DHA含量高于出发藻株的突变株。用筛选出的4株突变藻株LS1011、LS1022、LS1042、LS1057及出发藻株在相同的发酵条件下进行摇瓶发酵实验，对各藻株发酵生物量、总油脂产量和DHA产量进行测定，复筛结果见表1。对实验结果进行比较，在初始藻细胞密度相同情况下(均为106个/mL)，隐甲藻突变株LS1057 DHA含量明显高于其他3株藻株LS1011、LS1022和LS1042。因此隐甲藻突变藻株LS1057是目的藻株。

表 1 高产DHA的突变藻株Table 1 Production of docosahexaenoic acid in fermentation broth of mutant strains

2.3 高产藻株遗传稳定性实验

表 2 传代稳定性实验Table 2 Genetic stability of the mutant microalgae strains during subculture

作为生产菌株，其遗传稳定性对于生产具有非常重要的作用，为此将隐甲藻LS1057进行连续传代发酵培养，并测定DHA含量的变化，结果见表2。DHA的含量与传代前藻株相比无显著差异，结果表明隐甲藻LS1057具有良好的遗传稳定性，连续5次传代DHA的含量均维持在0.0697g/g干物质左右，未发生原位恢复突变等情况。

2.4 培养条件对目的藻株发酵的影响

2.4.1 起始pH值对目的藻株发酵的影响

表 3 初始pH值对隐甲藻LS1057生长及DHA产量的影响Table 3 Effect of initial pH on biomass and docosahexaenoic acid yield of C. cohnii LS1057

目的藻株在不同起始pH值培养基的生长情况，如表3所示。结果表明，突变株对培养基的起始pH有较好的适应性，既可以在弱酸性条件(pH5.5)下生长也可在弱碱性条件(pH7.5)下生长。但在偏酸性的初始条件(pH6.5)下，突变株生长情况最好，DHA的含量也是最高的。而王菊芳等[16]通过研究环境条件对隐甲藻ATCC30556生长及DHA产量的影响发现隐甲藻生长及DHA积累的最佳初始pH值为7.0，这可能是原始藻种经诱变后某些生长代谢途径发生变化的缘故。当pH值等于或大于7时，突变株在生长过程中可能会引起溶液的pH值持续升高，从而引起溶液的渗透压发生变化，导致藻细胞内外环境的渗透压平衡遭到破坏，进而对微生物的生长代谢产生抑制，严重的导致细胞死亡。以上结果表明，突变株产DHA的最佳初始pH值为6.5，过酸或过碱都会影响DHA的产量。

2.4.2 培养温度对目的藻株发酵的影响

温度是影响微生物生长繁殖的重要因素之一，温度的变化会对微生物的代谢过程产生影响，通过改变它们的生长速率，以适应温度的变化。培养温度对隐甲藻的生长繁殖以及DHA的产量都有重要的影响。培养温度高，隐甲藻代谢旺盛，生长繁殖较快，但不利于不饱和脂肪酸的积累。低温培养，隐甲藻生长速率较慢，但低温有利于不饱和脂肪酸的积累。对于不同的隐甲藻藻种，最佳的培养温度不同。

表 4 培养温度对隐甲藻LS1057生长及DHA产量的影响Table 4 Effect of culture temperature on biomass and docosahexaenoic acid yield of C. cohnii LS1057

由表4可知，培养温度越高越有利于突变株的生长繁殖因而生物量也就越高，总油脂和DHA的产量也相应升高；在温度为22～26℃的范围内，随着培养温度的升高，生物量、总油脂产量及DHA的产量逐渐增加，同时DHA的产量也逐渐升高。而在培养温度为26～30℃的范围内，随着培养温度的升高DHA的含量几乎呈直线下降，表明温度过高不利于藻体内DHA的产生和积累。这与Jiang Yue等[6]研究的温度对隐甲藻ATCC30556生长和DHA产量的影响的实验结果相一致，也进一步验证了温度对隐甲藻生长及DHA积累的影响情况。在发酵生产过程中，可采用梯度降温的方式，先将温度设为30℃，发酵一段时间后再将温度设为26℃，这将有利于提高DHA的最终产量。

2.4.3 摇床转速对目的藻株发酵的影响

摇床转速越高越有利于突变株的生长和DHA的积累，同时也表明突变株生长和积累DHA需要较高浓度的氧。但微生物对摇床转速都有一定的耐受性，转速过高可能会导致生长过程中菌体裂解，从而影响菌体的正常生长和产物的积累。

图 2 摇床转速对隐甲藻LS1057生长及DHA产量的影响Fig.2 Effect of shaking speed on biomass and docosahexaenoic acid yield of C. cohnii LS1057

由图2可知，在摇床转速为100～180r/min的范围内，培养突变株的最佳摇床转速为150r/min，与Jiang Yue等[6]的研究结果相吻合。

2.4.4 培养时间对目的藻株发酵的影响

图 3 培养时间对隐甲藻LS1057生长及DHA产量的影响Fig.3 Effect of cultivation time on biomass and docosahexaenoic acid yield of C. cohnii LS1057

由图3可知，随着时间的推移DHA产量先升高然后又下降。发酵216h时，生物量和DHA的产量达到最大，为缩短发酵周期提高发酵生产率，DHA的最佳收获时间定为216h。这与Ratledg[17]、de Swaaf[18]等以葡萄糖为碳源，研究分批补料培养隐甲藻ATCC30772生产DHA的发酵工艺，发现通过流加质量分数50%的乙酸来控制培养基的pH值，在210h时菌体生物量和DHA的积累达到最大值的研究结果相接近。

3 结 论

3.1 利用亚硝基胍作诱变剂，以隐甲藻ATCC30556为出发藻株，在150μg/mL的诱变剂量下处理30min，经过筛选得到一株高产DHA的突变藻株LS1057，且传代实验结果表明突变株遗传性状稳定。证明利用亚硝基胍诱变选育DHA高产的隐甲藻藻株是一种行之有效的方法。

3.2 采用高温摇瓶培养的方式对诱变后的藻株进行初筛，与随机挑选[8]的方式相比具有很强的针对性且增加了高产藻株筛选的概率。

3.3 在初始pH 6.5、温度26℃、转速150r/min、培养时间216h的发酵条件下，突变株的生物量达到14.06g/L，比出发藻株11.59g/L提高21.31%；总油脂产量达到3.14g/L，比出发藻株1.85g/L提高69.73%；DHA的产量达到了1.057g/L，比出发藻株0.477g/L提高121.59%；DHA的含量由出发藻株的0.0412g/g干物质提高到0.0752g/g干物质，提高了0.825倍，且发酵周期提前了24h，为利用该藻株进行DHA的大规模工业化生产提供参考。

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