葡萄醋抗氧化活性比较研究

孙莹莹，刘建书，李志西,*，张 强

(1.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100； 2.陕西省功能食品工程技术研究中心，陕西 西安 710054)

葡萄为葡萄属落叶木质藤本植物的果实，别名蒲萄、蒲桃、蒲陶、赐紫樱桃等。葡萄的营养价值很高，富含葡萄糖、有机酸及各种维生素。葡萄的保健功能源于它含有丰富的多酚类物质，如没食子酸、儿茶素、白藜芦醇、原花青素、单宁等[1]。植物多酚是一类很有应用前景的天然抗氧化剂及自由基清除剂[2]。Bagchi等[3]研究发现原花青素是很有效的自由基清除剂，王忠合等[4]研究证明原花青素具有很强的抗氧化、抗癌、保护心血管及抗衰老等多种功效。夏兰兰等[5]研究证明葡萄籽多酚化合物具有很强的抗氧化能力及抗癌作用。

葡萄醋以葡萄为原料，经过酒精发酵和醋酸发酵酿制而成，富含醋酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸等多种有机酸[6]，口感醇厚、风味独特，是集调味、营养、保健为一体的新型发酵制品。有关葡萄醋的研究前人已做了一定的工作。杨艳彬等[7]报道了一种葡萄醋发酵工艺，通过获得较高含量的白藜芦醇来提高葡萄醋的品质和保健功能。顾立众[8]设计了叠式动态表面发酵塔来生产葡萄醋。李凤英等[9]利用葡萄皮渣为原料酿造葡萄醋，为葡萄皮渣的综合利用提供一条新的思路。但是关于葡萄发酵产物(醋及其酒醪)的抗氧化活性比较研究目前还少见报道。本研究以巨峰、京亚、藤稔、美丽葡萄的鲜果为原料，比较不同品种的葡萄酿制的葡萄醋及其酒醪的抗氧化活性的强弱，为葡萄的深加工及综合利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

巨峰、京亚、藤稔葡萄采于河南偃师，美丽葡萄采于陕西杨凌西北农林科技大学葡萄酒学院示范基地。

酵母菌 湖北安琪酵母股份有限公司；醋酸菌 上海中科伍佰豪生物有限公司；福林酚试剂 上海荔达生物科技有限公司；芦丁、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美国Sigma公司；总抗氧化能力试剂盒 南京建成生物工程研究所；没食子酸 成都曼斯特生物科技有限公司；无水碳酸钠、无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁等常规试剂均为国产分析纯。

UV-1700型紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；HH-S4型数显恒温水浴锅 北京科伟永兴仪器有限公司；电子分析天平 北京赛多利斯天平有限公司；TD5A台式离心机 湖南凯达科学仪器有限公司；202-00干燥箱 北京化玻联医疗器械有限公司；喷射式自吸发酵罐 实验室自制[10]。

1.2 方法

1.2.1 葡萄醋发酵工艺

葡萄醋发酵操作要点：将清选后的葡萄鲜果轻度破碎后，加入0.1%活性酒用干酵母，置于10L的小型发酵罐内，在25℃的条件下进行酒精发酵72h后，离心分离(4000r/min，10min)得到葡萄酒醪。再按照1：10的体积比接入活化的醋酸菌液，于33℃的温度条件下，利用喷射式自吸发酵罐[10]进行液态深层发酵。

1.2.2 总抗氧化能力测定

总抗氧化能力测定采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒进行。在37℃条件下，每分钟内1mL样品溶液使反应体系的吸光度每增加0.01时，计为一个总抗氧化能力单位。

式中：A测定为测定管吸光度；A对照为对照管吸光度；N为反应体系稀释倍数(反应液总体积/取样量)；n为样品测试前稀释倍数。

1.2.3 还原能力测定

采用普鲁士蓝法[11]。分别取1.0mL不同体积分数的样品溶液，然后加入0.2mol/L pH6.6的磷酸缓冲液2.5mL混匀，再加入1g/100mL的铁氰化钾溶液2.5mL，充分混匀，置于50℃水浴20min后，加入10g/100mL的三氯乙酸溶液2.5mL，3000r/min离心10min，取上清液2.5mL，加蒸馏水2.5mL以及0.1g/100mL的FeCl3溶液1mL，混匀，在波长700nm处测定吸光度。

1.2.4 DPPH自由基清除能力测定[12-13]

将2mL 0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液分别加入到2mL含有20、35、50、65、80μL的样品水溶液中混匀，室温避光反应30min后，在波长517nm处测定吸光度记为Ai，同时将2mL DPPH乙醇溶液和2mL无水乙醇混匀按上述方法测定吸光度计为Ac，以及2mL样品水溶液和2mL无水乙醇混匀按上述方法测定吸光度记为Aj。根据式(2)计算清除率。

1.2.5 总多酚含量的测定

采用Folin-Ciocalteu法[14]，以没食子酸为标准品。准确配制0.02mg/mL的没食子酸标准溶液，分别吸取此标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL于10mL容量瓶中，依次加入Folin-Ciocalteu试剂1.0mL和7.5g/100mL碳酸钠溶液3.0mL，用蒸馏水定容至10mL，摇匀，显色2h，在波长765nm处测定吸光度。以吸光度(A765nm)为纵坐标，没食子酸质量浓度(mg/mL)为横坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程：y=99.371x+0.0168(R2=0.9993)。

将不同的样品稀释适当的倍数，配成样品溶液，准确吸取各种样品溶液1mL，分别置于10mL容量瓶中，按上述方法分别测定吸光度(A)，代入回归方程计算样品中的总多酚含量，每组做3个重复。

1.2.6 总黄酮含量的测定

采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法[15]，以芦丁为标准品。用120℃干燥至质量恒定的芦丁准确配制0.08mg/mL的芦丁标准溶液，分别吸取此标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL于10mL容量瓶中，加入5g/100mL的NaNO2溶液0.5mL混合均匀，放置6min，然后加入10g/100mL的Al(NO3)3溶液0.5mL混合均匀，放置6min，最后加入4g/100mL的NaOH溶液3mL，以蒸馏水定容，放置15min，在波长510nm处测定吸光度。以吸光度(A510nm)为纵坐标，芦丁质量浓度(mg/mL)为横坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程：y=11.538x+0.002(R2=0.9997)。

将不同的样品稀释适当的倍数，配成样品溶液，准确吸取各种样品溶液1mL，置于10mL容量瓶中，按上述方法分别测定吸光度(A)，代入回归方程计算样品中的总黄酮含量，每组做3个重复。

1.2.7 数据统计

实验数据用Excel软件处理，数据以±s的形式表示。

2 结果与分析

2.1 不同品种的葡萄醋及其酒醪总抗氧化能力比较

从图1可见，不同品种葡萄醋及其酒醪的总抗氧化能力有较大差异。其中，藤稔葡萄发酵产物(醋和酒醪)的总抗氧化能力最高，巨峰、京亚葡萄次之，美丽葡萄最弱；各品种葡萄醋的总抗氧化能力都稍低于相应的酒醪，表明在醋酸发酵过程中发酵液的总抗氧化能力有小幅下降。这与郑淑彦等[16]对枳椇醋发酵过程中发酵液的抗氧化活性的研究结果一致。还可以看出，葡萄醋的总抗氧化能力远高于苹果醋和桃醋。这可能是由于葡萄中含有比较丰富的多酚类物质，如白藜芦醇和原花青素等，经过酒精发酵和醋酸发酵，这些多酚类物质都很好的保留在发酵产物——葡萄醋中，所以使得葡萄醋的总抗氧化能力相对较强。

图 1 不同品种的葡萄醋及其酒醪的总抗氧化能力Fig.1 Total antioxidant capacity of vinegar and wine mash produced from different grape cultivars

2.2 不同品种的葡萄醋及其酒醪还原能力的比较

图 2 不同品种的葡萄醋及其酒醪的还原能力Fig.2 Reducing power of vinegar and wine mash produced from different grape cultivars

从图2可见，以苹果醋和桃醋为参照，4个品种的葡萄醋及其酒醪都有比较强的还原能力，测定结果明显高于苹果醋和桃醋。并且，随着样品加入量的增加，还原能力也随之增强，呈现明显的量效关系。葡萄醋及其酒醪的还原能力在品种间具有较大的差异，藤稔葡萄醋及其酒醪的还原能力最强，巨峰、京亚葡萄次之，美丽葡萄最弱。同一品种的葡萄酿制的葡萄醋与其酒醪的还原能力比较接近。一般而言，样品的还原能力通常与其抗氧化能力呈正相关，本研究与前人研究结果[17-19]一致。

2.3 不同品种的葡萄醋及其酒醪清除DPPH自由基能力的比较

图 3 不同品种的葡萄醋及其酒醪清除DPPH自由基的能力Fig.3 DPPH radical scavenging capacity of vinegar and wine mash produced from different grape cultivars

从图3可见，葡萄醋及其酒醪清除DPPH自由基的能力在品种间差异很大；同一品种葡萄酿制的葡萄醋与其酒醪在清除DPPH自由基的能力方面差异较小。藤稔葡萄发酵产物清除DPPH自由基的能力最强，巨峰、京亚葡萄次之，美丽葡萄最弱。这与总抗氧化能力和还原能力的测定结果高度一致，其原因可能与葡萄中的总多酚、总黄酮含量有关。4个葡萄品种酿制的醋及其酒醪清除DPPH自由基的能力都远远大于桃醋和苹果醋，并且随着加入量的增加，清除率也随之增加，呈现出明显的量效关系。

2.4 不同品种的葡萄醋及其酒醪总多酚、总黄酮含量的比较

黄酮是一类在植物界中分布广泛、具有多种生物活性的多酚类化合物，在人体内可以清除游离自由基，具有抗衰老、预防心血管疾病和癌症等功效[20]。植物多酚类物质具有很好的抗氧化功能，一般来说总多酚含量越高，其抗氧化活性就越强[21]。不同品种的葡萄醋及其酒醪的总黄酮及总多酚含量的测定结果如表1所示。

表 1 不同品种的葡萄醋及其酒醪中总黄酮和总多酚的含量Table 1 Total phenol and total flavonoid contents of vinegar and wine mash produced from different grape cultivars mg/L

从表1可见，葡萄酒醪及其醋的总黄酮和总多酚含量在品种之间有较大的差异。样品总多酚含量排序为：藤稔酒醪＞藤稔醋＞巨峰醋＞巨峰酒醪＞京亚醋＞京亚酒醪＞美丽酒醪＞美丽醋＞桃醋＞苹果醋，总黄酮含量的高低排序与总多酚含量的排序一致。

Yang Jun[22]、Dávalos[23]等得出葡萄的抗氧化活性与酚类物质的含量密切相关。为了验证葡萄醋及其酒醪的抗氧化活性是否也与总多酚、黄酮含量密切相关，故以总多酚、黄酮含量与实验样品的还原能力， DPPH自由基的半清除率(IC50)及总抗氧化能力进行相关性分析，结果如表2所示。

表 2 抗氧化活性与总多酚及其总黄酮含量的相关系数(n=8)Table 2 Correlation coefficients between antioxidant activity and the contents of total phenol or total flavonoid

从表2可见，葡萄发酵产物的抗氧化活性与多酚类物质含量有很强的相关性(P＜0.01)，多酚类化合物是葡萄醋及其酒醪中的主要抗氧化成分。

3 结 论

本研究初步评价了4个品种的葡萄酿制的葡萄醋及其酒醪的抗氧化活性。通过葡萄醋与桃醋和苹果醋对比实验，发现4个品种的葡萄醋抗氧化活性均远高于桃醋和苹果醋，说明葡萄醋有比较强的抗氧化活性。葡萄醋及其酒醪的抗氧化活性在品种间差异很大，藤稔葡萄的发酵产物抗氧化活性最强，巨峰、京亚葡萄次之，美丽葡萄最弱；葡萄醋及其酒醪的抗氧化活性与总多酚和总黄酮含量有极显著(P＜0.01)的相关关系。

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