响应面法优化内部沸腾法提取三七多糖

温拥军，蒋琼凤，郭 浪

(1.湖南化工职业技术学院，湖南株洲412004;2.湖南科技学院，湖南永州425100)

三七(Radix Notoginseng)又称田七，为五加科人参属多年生草本植物，是一种名贵的中药材，具有止血化瘀、消肿止痛等功效［1］。三七中主要含皂苷、多糖、黄酮类化合物、挥发油等成分。研究表明［2-6］，三七多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗辐射、抗氧化和延缓衰老等多种功效。目前，多糖的提取方法主要有水提法、醇提法、酸碱提法、酶提法、微波辅助法等，前三种提取方法耗时长、杂质多，酶提法成本高，而微波辅助则设备昂贵，影响了其在工业生产中的应用。韦藤幼等报道［7］提出了采用内部沸腾提取植物有效成分的方法，即先用少量低沸点溶剂(如乙醇)充分润湿被提物料，然后迅速加入超过溶剂沸点温度的提取液，使渗透到物料内部的低沸点溶剂发生汽化，产生内部沸腾，形成对流，从而强化提取过程，提高提取效果。响应曲面法是一种实验优化设计方法，与正交等传统实验设计方法相比，它具有高效经济、精准度高、能研究多因素间交互作用等优点［8］，已被广泛应用到生物工程、食品工程、化学工程等领域［9］。本实验采用响应面法优化内部沸腾法提取三七多糖工艺条件，旨在为进一步开发和利用三七这一名贵药用植物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

三七 购于株洲市药材市场;葡萄糖、3，5-二硝基水杨酸、钨酸钠、酒石酸钾钠、NaOH、结晶酚、亚硫酸钠、乙醇等 均为分析纯。

DHG-9140A 型干燥箱 上海精宏实验设备有限公司;HH.SYH-Ni2-C 水浴锅 北京长源实验设备厂;SB-5200 超声波清洗器 上海新芝生物技术研究所;LDZ4-0.8A 离心机 北京医用离心机厂;UV-9100紫外可见分光光度计 北京瑞利分析仪器公司;FW-200 型高速万能粉碎机 北京中兴伟业仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 三七干粉的制备 将三七洗净后，置于80℃烘箱中烘干后粉碎，过80 目筛，制成三七干粉，备用。

1.2.2 内部沸腾法提取三七多糖 称取1g 三七干粉加入适量的60%的乙醇，置于功率为200W 的超声波清洗器中，保持15min，使乙醇充分润湿物料。迅速加入一定量的高温热水，并置于与热水相同温度的水浴中提取一定时间后，抽滤，取一定量的滤液离心，取上清液测多糖含量。

1.2.3 三七多糖测定方法 采用文献［10］中的DNS法测定。取葡萄糖于105℃干燥至恒重，准确称取100mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100mL，配成1.0mg/mL 的葡萄糖标准溶液。取7 支试管，分别加入葡萄糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL，加蒸馏水补充至每管总体积为2mL，然后各加入1.5mL DNS 试剂，混匀并置于沸水中加热5min，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管加入21.5mL 蒸馏水，摇匀，测A540nm。以葡萄糖含量(mg)为横坐标，A540nm为纵坐标，绘制标准曲线。取1g 三七干粉，按1∶20(g/mL)加入60%乙醇，置于超声波清洗器中，在温度为60℃条件下提取30min，小心倒出上清液，重新添加60%乙醇，重复提取4 次，合并所有提取液，置于4000r/min 离心机中离心10min，取上清液适当稀释，按DNS 法测540nm 处吸光值(A)。以吸光值对应的多糖量乘以稀释倍数，除以样品的质量，即得到三七总多糖。各实验条件下提取的多糖量按如下公式计算:

式中:c 为被测液A 值所对应标准曲线中葡萄糖浓度(mg/mL);D 为稀释倍数;V 为样品液总体积(mL);m 为投加的三七干粉质量(g)，0.9 为葡萄糖与多糖的换算系数。

1.2.4 相对提取率的计算 Y(%)=［m提/m总］×100，式中:Y 为三七多糖相对提取率，m提为某次提次的三七多糖量;m总为按实验方法测得的三七多糖总量。

1.2.5 三七多糖提取条件优化方法 单因素实验主要考察提取温度，料液比，提取时间3 个因素，提取温度选取75、80、85、90、95、100℃5 个水平，料液比选取1∶16、1∶18、1∶20、1∶22、1∶24(g/mL)5 个水平，提取时间选取4、5、6、7、8min 5 个水平，按1.2.2 实验方法进行研究，确定各因素最佳水平;在此基础上，采用Box-Behnken 实验设计进一步优化，确定内部沸腾法提取三七多糖的最佳条件。

1.3 数据分析 采用Minitab15.0 软件对实验数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线及总多糖含量测定结果

葡萄糖标准曲线如图1 所示，由图可知，在0～1.2mg/mL范围内，葡萄糖浓度与吸光值A 呈线性关系。按实验方法测得三七总多糖含量为85.8mg/g。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose

2.2 单因素实验结果与分析

2.2.1 提取温度对三七多糖相对提取率的影响 提取温度对三七多糖相对提取率的影响见图2。由图2可知，当温度低于85℃时，相对提取率随温度的升高而增加，超过85℃则下降。这是因为60%乙醇在常压下的沸点为81℃左右［11］，当温度低于此，物料内部乙醇未产生沸腾，5min 内提取不完全，故提取效果差;但当温度过高时，乙醇沸腾过快，有效提取时间减少，且三七具有溶胀性，温度过高容易造成大分子通道阻断，进而影响提取率［12］，故最佳提取温度为85℃。

图2 提取温度对三七多糖提取的影响Fig.2 Effect of temperature on RNP extraction

2.2.2 料液比对三七多糖相对提取率的影响 料液比对三七多糖相对提取率的影响结果见图3。图3结果表明，三七多糖的相对提取率随料液比的减少而增加，当料液比为1 ∶20 时，相对提取率达到84.46%，继续降低料液比提取率趋于稳定。而低料液比会造成提取剂的浪费和后续浓缩的困难。故最适料液比为1∶20。

2.2.3 提取时间对三七多糖相对提取率的影响 提取时间对三七多糖相对提取率的影响结果如图4 所示。由图4 可知，采用内部沸腾法提取速度很快，5min 内基本能完成多糖的提取，相对于超声辅助等提取方法，该法能大大缩短提取时间，具有明显的优势。因此，提取时间选择为5min。

2.3 响应面优化实验结果与分析

通过单因素实验，确定了提取温度(X1)、料液比(X2)、提取时间(X3)的最佳水平，以各因素的最佳水平为中心(X =0)，运用Box-Behnken 实验设计对提取条件进一步优化，利用Minitab15.0 软件设计一个3因素3 水平共15 个实验点的实验设计，其中中心点重复3 次，用来计算实验误差，所得结果如表1 所示。

图3 料液比对三七多糖提取的影响Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on RNP extraction

图4 提取时间对三七多糖提取的影响Fig.4 Effect of time on RNP extraction

表1 Box-Behnken 实验设计及结果Table 1 Box-Behnken design and experimental results

以三七多糖相对提取率为响应值，以提取温度(X1)、料液比(X2)、提取时间(X3)为自变量，用Minitab15.0 软件对表1 所得数据进行多元回归分析，得到结果见表2、表3。结果表明，模型在α =0.05 水平上回归显著;失拟项p ＞0.1，失拟不显著;其中，X1、X2、平方项以及X1X2项对三七多糖相对提取率有显著影响，X3、X1X3项不显著。得到回归方程:三七多糖相对提取率Y(%)= 84.58 + 0.56X1+1.06X2- 0.83X12- 2.86X22- 1.44X32+ 1.76X1X2+0.57X2X3。决定系数R2为97.70%，说明模型拟合程度好。求解模型得到各因素最佳水平为:提取温度X1= 89.4℃、料液比X2= 1 ∶19.1、提取时间X3=5.08min，模型预测结果为85.05%。考虑到实际操作情况，将最佳条件修约为:提取温度X1=89℃、料液比X2=1∶19、提取时间X3=5min。在最佳条件下进行验证，3 次实验取平均值，结果为84.86%，说明该模型可以用来指导实际生产，有实用价值。

表2 模型的回归分析Table 2 Regression analysis of model

根据回归方程绘制的响应面图见图5～图7，响应面可以直接反映各因子对响应值影响的大小。

图5 Y=f(X1，X2)响应面立体分析图Fig.5 3D analysis chart of y=f(X1，X2)

从图5 可知，提取温度X1与料液比X2交互作用显著，固定提取时间X3为0 水平时，当提取温度为88.3℃、料液比为1∶19.2 时，三七多糖相对提取率存在最大值，可达85.01%。

图6 显示，固定提取温度X1为0 水平时，料液比X2与提取时间X3交互作用较显著，当料液比为1∶19.6时，提取时间在4～5.17min 范围内，三七多糖相对提取率呈明显上升趋势，在5.17～6min 内呈下降趋势。当提取时间为5.17min，料液比对响应值的影响呈先升后降趋势，在1 ∶19.6 时达到极大值，为84.69%。

图7 显示，固定料液比X2为0 水平时，提取温度X1与提取时间X3交互作用不显著，固定提取温度不变时，提取时间在4～6min 范围内，三七多糖相对提取率呈先升后降之势。而当固定提取时间时，提取温度在85～86.8℃内，三七多糖相对提取率上升并达到最大值，为84.67%。

表3 模型的方差分析Table 3 Variance analysis of model

图6 Y=f(X2，X3)响应面立体分析图Fig.6 3D analysis chart and y=f(X2，X3)

图7 Y=f(X1，X3)响应面立体分析图Fig.7 3D analysis chart of y=f(X1，X3)

3 结论

本文采用单因素结合响应曲面法对内部沸腾法提取三七多糖的条件进行了研究。选取了提取温度，料液比，提取时间进行单因素实验，确定了各因素最佳水平，在此基础上，运用Box-Behnken 实验设计对提取条件进一步优化，建立了关键影响三七多糖提取率的二次多项式，得到最佳提取条件为:提取温度X1= 89℃、料液比X2= 1 ∶19、提取时间X3=5min，在此条件下，三七多糖相对提取率可达84.86%。

内部沸腾法应用于提取植物有效成分，具有速度快，提取率高的特点［13］。在本实验中，对三七前处理阶段采用超声辅助，使三七干粉与乙醇在更短的时间内充分润湿和渗入，进一步节约了提取时间，提高提取效果，本实验中三七多糖提取过程仅20min即可完成，并能达到较高的提取效果。因此，该法是一种安全、高效、简便的植物有效成分提取方法。

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