几种物质对亚硝酸盐清除作用的比较

艾对元，张卫兵，冯丽丹，齐燕姣，贠建民，毕 阳，郑惇元

(1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070;2.西北民族大学化工学院，甘肃兰州730030)

亚硝酸盐结晶为白色粉末，易溶于水。硝酸盐和亚硝酸盐在食品加工过程中主要用作发色剂、防腐剂及肉制品増香剂［1］。但亚硝酸盐具有较强的毒性，过量添加对人体有害［2］。同时其次生产物N-亚硝胺是一种致癌性很强的化合物［3］。因此，阻断亚硝胺合成［4］或消除亚硝胺的前体物质［5］是防治癌病产生的有效途径之一。目前有很多清除食品中亚硝酸盐的相关研究，最常采用的是果［6-7］、蔬品种［8］，其含有的VC、茶多酚、黄酮类、色素和有机硫化物等物质能有效地阻断亚硝胺类化合物的合成［9］。我们从文献中筛选出抗坏血酸(VC)、儿茶酚、葡萄糖、牛血清白蛋白(BSA)等若干具还原性的可食性化合物，采用对氨基苯磺酸-盐酸萘乙二胺分光光度法，考察其对亚硝酸盐的清除能力。VC是公认的能够彻底清除亚硝酸盐的物质，它能还原亚硝酸盐［10］;儿茶酚多数以衍生物的形式存在于自然界中［11］。水果及蔬菜中通常存在的有机酚，是植物鞣质的成分，在体内可氧化成醌，因此它具有极强的抗氧化性;BSA 结构中包含17 个二硫键和一个巯基［12］，因此可与多种阳离子，阴离子和小分子结合［13］;D-葡萄糖是自然界广为存在的一种还原性己醛糖。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

0.4%对氨基苯磺酸溶液、0.2%盐酸萘乙二胺溶液、200μg·mL-1亚硝酸钠标准溶液、5μg·mL-1亚硝酸钠标准使用液、0.2mol·L-1乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH3.6～pH5.8)、0.1mol·L-1盐酸 均为天津市光复科技发展有限公司所生产的“南开牌”分析纯药品。

UV-2450 紫外可见分光光度计 SHIMAD-ZU，日本岛津;WZ-100S 数显恒温水浴锅 上海一科仪器设备有限公司;电子天平XB1200C 上海精密仪器仪表有限公司;组织捣碎机DS-1 金坛市万华实验仪器厂;pHS-3C 型酸度计北京华瑞博远;FRESCO17 型离心机 Thermo，赛默飞世尔中国;恒温干燥箱101-2 上海实验仪器厂等。

1.2 标准曲线

参照张婕莉等方法［14］，测得亚硝酸钠最大吸收波长为540nm。在此波长处亚硝酸盐浓度与吸光度值成良好的线性关系，实际测得线性回归方程Y =0.132X +0.0092，决定系数R2=0.9976。

Y =540nm 下的吸光值;X =亚硝酸盐标准使用液用量

1.3 亚硝酸盐的清除率测定

以樊明涛［15］的对氨基苯磺酸-盐酸萘乙二胺分光光度法为准，计算样液对亚硝酸盐的清除率公式如下:

R:清除率(%);A1:未加样液亚硝酸钠的吸光度;A2:加提取液后亚硝酸钠的吸光度(已减去清除物质的吸收度)。

1.4 实验设计

单因素实验时，先考虑四种清除物质的浓度，设定VC的变动范围为0.01%～1%;其它三种的范围均定为0.01%～5%，与亚硝酸盐作用60min 后，观察清除效果。然后以各自最佳浓度为定值，变动反应时间，得出最适清除时间。以上反应均是在室温(20℃)，自然pH 条件下进行;均匀实验设计采用4因素5 水平即U5(54)均匀表头(表1)，在单因素得到的最适因素水平附近，共进行5 组10 次实验(表2)，然后根据实验结果通过SPSS16.0(Release16.0.0(Sep，13，2007).copyright(c).SPSS-IBM.inc.，1989-2007)进行数学分析。

表1 抗坏血酸U5(54)均匀实验因素水平表Table 1 The uniform deseign U5(54)of VC

表2 儿茶酚U5(54)均匀实验因素水平表Table 2 The uniform deseign U5(54)of catechol

2 结果与分析

2.1 反应物浓度单因素实验

结果显示(图1、图2)，四种反应物浓度对亚硝酸盐清除率均有一定的影响。随着反应浓度的增大，VC对亚硝酸盐的清除率也相应增加。当其浓度为0.5%～1%时，清除率趋于平缓，稳定在95%左右，浓度1%时清除率最大;儿茶酚对亚硝酸盐的清除率随其浓度呈线性增长，达到5%时清除率最大，接近60%;葡萄糖对亚硝酸盐的清除率成跳跃状改变，在浓度为5%时达到峰值，为8.32%;牛血清白蛋白对亚硝酸盐的清除率随其反应浓度呈S 形变化。当反应物浓度为0.5%时清除率达到9%，随后出现下降。因此，葡萄糖和BSA 对亚硝酸盐的清除能力均小于10%，清除效果不理想。

图1 不同浓度VC 对亚硝酸盐的清除作用Fig.1 Effect of the diffrent concentration of on the scavenging of nitrite

图2 儿茶酚、葡萄糖、BSA 不同浓度对亚硝酸盐的清除作用Fig.2 Effect of the 3 substances concentration on the scavenging of nitrite

2.2 反应时间单因素实验

在起始阶段，随着反应时间的延长，这四种物质对亚硝酸盐的清除率均逐渐增大。VC于60min 时清除率最大，为81.94%，随后稳定在80%左右(图3);儿茶酚于60min 时清除率最大，为41.59%，随后出现下降;葡萄糖于120min 时清除率最大，为7.90%;但是时间对BSA 的清除率影响不大，当60min 时其清除率达到峰值5.55%，随后稳定在5%左右。

对在不同反应液浓度、反应时间下葡萄糖、牛血清白蛋白对亚硝酸盐的清除率在0.01 的显著性水平下用SPSS16.0 做独立样本T-检验(表3)。可以看出，葡萄糖和BSA 对亚硝酸盐清除率的平均值分别为0.0578(5.78%)，0.0685(6.85%)。根据单样本t检验，设置检验值为0.1(10%的清除率)时，它们的T检验值的伴随概率均都极显著的小于0.01，即它们的清除率期望值都不到10%，因此可以认为它们对亚硝酸盐无显著的清除能力。

表3 独立样本T-检验统计表Table 3 Independent sample T-test results

图3 四种物质不同时间对亚硝酸盐的清除作用Fig.3 Effect of the 4 substances reaction time on the scavenging of nitrite

2.3 均匀实验

因为葡萄糖和BSA 对亚硝酸盐无显著的清除能力，所以以反应液浓度(A)，反应时间(B)，反应pH(C)，反应温度(D)4 个不同因素，根据均匀实验要求，结合单因素实验结果，通过U5(54)均匀表确定VC、儿茶酚实验方案，得到实验结果(表4、表5)及回归方程(表6、表7)。

表4 VC U5(54)均匀实验结果Table 4 U5(54)uniform experiment results of VC

表5 儿茶酚U5(54)均匀实验结果Table 5 U5(54)uniform experiment results of catechol

实验结果通过SPSS16 分析，确定均匀实验当中抗坏血酸对亚硝酸盐清除率的线性回归方程为:Y =-0.0815-1.0470X1+0.0625X2+0.2532X3-0.0356X4，方程的决定系数R2=0.9984，方程的总体显著性p =3.60 ×10-7，说明此方程线性拟合很好，具有极显著意义(表6);儿茶酚对亚硝酸盐清除率的线性回归方程为:Y =0.3991-0.0784X1+0.0204X2-0.0113X4，此方程R2=0.9985，p =7.49E-09，线性拟合很好，且具有极显著意义(表7)。从以上2 个均匀实验线性模拟来看，X1即清除剂浓度对清除率影响极显著，当然浓度值有一定限度，所以其系数是负值;X2即反应时间，它与清除率呈正相关，时间越长，清除作用越彻底;X3即pH，对VC的影响极显著，因为当溶液变成碱性时，VC的结构将被破坏，只有在酸性条件下，其清除作用才最有效［16］。但pH 对儿茶酚却没有显著影响;最后是X4即反应温度，其系数是负值，表明低温有利于清除作用。因此，调整清除剂浓度，延长反应时间，控制反应液的pH，降低反应温度等条件，是提高亚硝酸盐清除率的重要手段。通过模型计算，当VC浓度＜0.7%，反应时间＞15min，4 ＜pH ＜8，温度＜4℃时，清除率＞=100%，这点不难从VC均匀实验结果第四项得到验证，实际清除率达到99.45;同理，对于儿茶酚，利用该线性模型预测，其浓度＜1%，反应时间＞40min，温度＜15℃时，清除率＞=100%。而儿茶酚均匀实验结果第2 项显示实际清除率为93.38%。因此，这二种模型都是比较理想的，可以作为VC、儿茶酚清除亚硝酸盐的数学表达。

表6 VC的回归方程方差分析Table 6 Multiple linear regression analysis of VC

表7 儿茶酚的回归方程方差分析Table 7 Multiple linear regression analysis of catechol

3 讨论与结论

3.1 讨论

根据现有的研究结果，表明亚硝酸盐的清除主要有两种方式，一种是酶降解途径，另一种是非酶降解途径［17］。酶降解途径可以通过细菌的亚硝酸盐还原酶将其还原成NO，NH3。另外就是被机体的一些黄嘌呤氧化还原酶(Xanthine oxidoreductase)，亚硝酸盐还原酶(Nitrite reductase)，NO 合成酶(NO synthase(NOS))等还原成NO［18］。而NO 可以促进血管扩张及血液循环，业已被证明是一种存在于动植物中的信号分子，而且被应用于医疗药物中。非酶降解途径是通过一些强还原性物质如VC、黄酮类［19］及杂环类等物质，将其还原成成NO，N2O，H2N2O2，N2等物质［20］，从而降解亚硝酸盐。从实验结果来看，VC、儿茶酚对亚硝酸盐的清除效果分别达到99.45%，93.38%;理论预测它们可以彻底地清除亚硝酸盐。因为这二种物质都属于强还原剂。儿茶酚是邻苯二酚，属于多羟基酚;而VC化学官能团里含有-NH2，-OH及还原性羰基及酚基，所以他们可以通过非酶方式清除亚硝酸盐，而且它们的清除作用与时间正相关，这更加说明非酶反应随时间而逐步完成［21］。同时，VC、儿茶酚是大多数氧自由基的清除剂，因而能阻断亚硝胺的合成。而葡萄糖和BSA 对亚硝酸盐的清除率最高只有8.32%、10.93%(单因素实验中出现的最大值，未做算数平均)，葡萄糖存在于日常饮食及机体内，而BSA 类似于人的免疫球蛋白，它们均不能还原亚硝酸盐。因此，只有一些高还原性的生物活性物质如黄酮类、多糖、色素等［22］，才能有效清除亚硝酸盐。

3.2 结论

从反应液浓度、反应时间等条件看来，葡萄糖、牛血清白蛋白这两种物质，对亚硝酸盐的清除能力作用不明显，均显著低于10%。均匀实验结果表明，抗坏血酸的浓度为0.7%、反应时间15min、反应pH4、反应温度4℃时，对亚硝酸盐的清除率最大，达到99.45%;儿茶酚的反应浓度为1%、反应时间40min、反应pH2、反应温度20℃时，其对亚硝酸盐的清除率最大，达到93.38%。通过均匀实验得到的线性模型表明，VC、儿茶酚都可以彻底清除亚硝酸盐。

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