响应面法优化香橼果胶提取工艺

牛丽影，李大婧，刘春泉，*

(1.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏南京210014;2.国家农业科技华东(江苏)创新中心农产品工程技术研究中心，江苏南京210014)

香橼(Citrus wilsonii Tanaka)为柑橘属植物，树形优美，果实气味芳香清灵［1］。香橼在中国已有两千余年的栽培历史，是一种药食同源的经济作物，其干燥果实为我国传统中药，可用于多种复方制剂。国内外关于香橼的研究较少，仅有少量植物学分类［2］、中药学鉴定［3-4］、栽培繁育［5］的报道，而国外仅有其近缘种枸橼(Citrus medica L.)精油成分及生物活性［6］的报道。目前，香橼在我国作为园林观赏植物广为栽培，尤其在江苏省靖江市，香橼作为市树，实现规模化种植，2012 年果实产量达到3000t 左右，为实现资源的充分利用，当地研制的香橼饮料因其清爽宜人的口感及香气受到广大消费者的欢迎［7］。但是加工饮料后，大量果皮果渣的利用成为迫切需要解决的问题。从柑橘类果皮果渣中提取果胶一直是重要的果胶来源，果胶作为一种天然线性高分子化合物，具有良好的凝胶性和乳化稳定性，并具有抗腹泻、抗癌、减肥和治疗糖尿病等作用，可广泛用于食品、医药、日化产品中［8-9］。果胶提取的方法有多种，目前商业上多采用在加热条件下，利用稀酸使细胞壁中的果胶释放，再用乙醇沉淀收集果胶［10-11］。在提取工艺优化方法中，响应面法能够在小区域内用简单的一次或二次多项式模型来拟合因素与结果间的全局函数关系，从而得到准确有效的结论［12］。因此，为确定香橼果胶提取参数的优化，本研究采用响应面法进行实验设计，系统研究了影响果胶得率的主要因素及其相互关系，并采用响应面法拟合得到回归方程，优选出优化工艺条件，为工业生产开发提供有价值的工艺参数。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

香橼鲜果 江苏省靖江市，手工分离的香橼果皮在60℃烘箱烘干，研磨机磨粉，过20 目筛，备用;无水乙醇 南京化学试剂有限公司。

HH-8 数显恒温水浴锅 金坛市荣华仪器制造有限公司;TDL-5-A 型大容量离心机 上海安亭科学仪器厂;PHS-5 型pH 计 上海康仪仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 提取方法 称取香橼果皮粉1.0g 于50mL 离心管内，按照设定料液比加入蒸馏水，用6mol/L 的盐酸调节pH 至设定值，置于设定温度水浴，至设定时间取出离心，取上清液按照体积比1∶1 加入无水乙醇，离心得到沉淀出的果胶。将醇沉得到的果胶加入无水乙醇20mL，搅拌再离心除去醇溶性杂质，用无水乙醇洗涤至离心后的上清液穆立虚反应［13］为阴性，然后将得到果胶在250mL 容量瓶用水定容，参照庞荣丽等的方法［14］，利用硫酸-咔唑比色法计算果胶含量。上述过程中离心条件均为5000 ×g，15min。

1.2.2 单因素实验 首先在pH 为1.8，85℃提取2.5h 条件下，研究不同液固比(15mL/g、20mL/g、25mL/g、30mL/g)对得率的影响，其次在优选的液固比及85℃提取2.5h 条件下，分析不同pH(0.8、1.8、2.3、2.8、3.0)对果胶得率的影响，最后在优选的液固比和pH 下，分别在65、75、85、95℃温度下进行水浴，管内温度达到各设定温度后开始计时，计时满0.5h 后每间隔0.5h 取出离心管，自来水冲凉至室温，至计时3.0h，即各温度下均有六个不同酸解时间的样品，得到各温度下果胶得率随时间变化的曲线。以上实验每个处理均进行三次重复。

1.2.3 果胶得率计算方法 以萃取得到的果胶得率作为度量标准，公式为:

式中:x1-果胶质量，g;m-果皮粉质量，g。

1.2.4 响应面法实验设计 对料液比、萃取pH、萃取温度(℃)、萃取时间(h)四个影响萃取率的主要因素进行优化实验。Box-Behnken 设计的四因素三水平编码表如表1 所示。根据实验方案进行实验后，对实验数据进行二次回归拟合，求得回归方程。

表1 实验因素水平编码表Table 1 Code and levels of factors design for experiment

1.3 数据分析

单因素实验数据应用采用Origin Pro7.5(Origin Lab Corp.，Northampton，MA，USA)进行单因素方差分析，p ＜0.05 为差异显著。响应面实验设计与统计分析利用软件Design expert 7.1(Stat-ease Inc.，MN，USA)完成。

2 结果与分析

2.1 液固比对果胶得率的影响

液固比对果胶得率的影响如图1 所示。在液固比25mL/g 时，得率最高。在提取的过程中，物料粉末在水中的溶胀特性、以及酸解后果胶的粘度对液固分离的影响直接影响果胶的得率，并体现为液固比的作用。液固比太低，液固分离过程造成的损失加大，但过高液固比也未能增加果胶的得率，反而会增加醇沉工序中醇的用量，甚至有可能由于其他水溶或酸溶性成分进入提取液中相对浓度的增加而导致果胶提取得率的降低。鉴于上述实验结果，选择25mL/g 进行后续的单因素实验。

图1 液固比对香橼果皮果胶得率的影响Fig.1 Effect of liquid-solid ratio on yield of pectin

2.2 pH 对果胶得率的影响

如图2 所示，在测定的pH 中，pH1.8 时的果胶得率最高。果皮中的果胶多以原果胶的形式存在，原果胶在稀酸溶液中水解为水溶性果胶，从而使果胶从果皮转到水相。果胶的酸离解常数变化范围为3.55～4.10［15］，D-半乳糖醛酸的酸离解常数为3.52。本实验在液固比25mL/g 的情况下，香橼皮粉水溶液的初始pH 为3.26，因此选择低于3.0 的pH 进行研究。溶液pH 偏高，提取时间将会延长，果胶的稳定性下降，容易分解成果胶酸，使产率下降。而pH 过低，提取时间缩短，造成果胶进一步分解，导致果胶损失，使产品得率降低，同时也使果胶色泽加深［16］。pH2.0 左右作为果胶提取的最佳pH 在其他柑橘类果胶提取中也多有报道［17-18］，因此选择在pH1.8 条件下，考察温度与时间因素对得率的影响。

图2 pH 对果胶得率的影响Fig.2 Effect of pH on the yield of pectin

2.3 萃取温度和时间对果胶得率的影响

由图3 可知，在不同温度下，果胶的得率出现了不同的变化趋势。在较高温度95、85 和75℃下，最高值分别出现在0.5、1.5 和2.0h，随着提取时间的进一步延长，果胶得率下降。而在较为温和的65℃条件下，果胶得率整体偏低，最高值出现在1.5h。较高温度下萃取时间过长，可能使果胶发生β-键消除作用而解聚，从而影响果胶的产量［19-20］。

图3 温度对果胶得率的影响Fig.3 Effect of temperature on the yield of pectin

2.4 响应面实验

按照实验设计方案进行实验，结果见表2。

表2 响应面实验设计条件及结果表Table 2 Design and results of response surface experiment

对表2 在不同条件下所获得的果胶得率，利用design expert 7.1 统计软件进行二项式回归拟合，得到回归方程:

由表3 对方程进行F 检验可得出，失拟检验得到p =0.0870，检验不显著，说明其它因素对实验结果干扰很小;拟合模型的p ＜0.0001，检验极显著，说明方程与实际情况拟合良好，能够反映果胶得率与液固比、萃取pH、萃取温度、萃取时间之间的关系，同时复相关系数R2=0.9881，可以利用此模型对实验中果胶率进行分析和预测。

表3 回归方程方差分析表Table 3 Variance analysis results of regression equation

回归系数取值及方差分析结果见表4。

表4 回归系数显著性检验Table 4 Test of significance for regression coefficient

由表4 显著性检验可知，x1、x2、x3、x1x3、x3x4、x12、x22、x32、x42项对得率有显著影响，设定的四个因素中液固比、pH、温度对得率的影响均达极显著水平，虽然时间对得率影响不显著，但是时间与温度的交互作用达到显著水平。通过对回归方程进行中心标准化处理，从回归系数绝对值的大小来分析各个因素的改变对萃取率影响的大小。回归方程一次项的回归系数绝对值大小依次为x2＞x3＞x1＞x4，表明pH 对果胶得率的影响最大，其次萃取温度、液固比和萃取时间。

2.3 果胶得率响应面分析

将二项式方程中的液料比、pH、提取温度和提取时间分别固定在零水平，做出交互效应响应面图，根据曲面变化可对各因素的作用特点获得直观的解释［21］。如图4 所示，在pH 与液固比、时间及温度的响应曲面中可以发现当其他两个因素维持不变时，果胶得率均表现出随pH 升高先升高后下降的趋势，在pH2.0 左右出现最大值。在时间与pH 的响应曲面中，曲面随时间变化相对平滑，说明果胶得率对pH 变化比对时间变化更为敏感。当pH 与时间维持不变时，随温度升高，料液比对果胶得率的影响减小;同样pH 与液固比维持不变时，随温度升高，时间对果胶得率的影响减小，说明温度与液固比、温度与时间因素间存在显著的交互作用，这可能是由于较低液固比时果胶溶液的粘度较大，影响了分离效果，而较高温度减弱了液固比造成的影响;另一方面在较高温度下果胶的水解速度加快，也构成了温度与时间显著的交互作用。

图4 各因素对果胶得率影响的响应曲面图Fig.4 Response surface and contour plot of the factors

2.4 验证实验及最佳萃取条件的确定

根据模型，利用Design expert 7.1 软件计算得到最优工艺方案:液固比26.29mL/g，pH1.95，反应温度82.11℃，反应时间1.85h，得率为15.41%。为方便实际操作，将优化参数调整为液固比25mL/g，pH2.0，反应温度85.0℃，反应时间1.75h，在此优化条件重复实验5 次，实际测得的平均得率为15.37%～15.68%，平均值为15.52%，与理论预测值相比，其误差低于1.0%，说明基于响应曲面法所得的优化提取工艺参数具有一定的实际指导意义。

3 结论

本研究以果胶得率为指标，采用响应面分析方法中的Box-Behnken 实验设计，得到料液比、萃取温度(℃)、萃取pH、萃取时间(h)四个因素的二项式回归模型，经过方差分析显示该模型较好地反映了各因素果胶得率的影响，并得到最适工艺条件为液固比25mL/g，pH2.0，反应温度85.0℃，反应时间1.75h，此条件下果胶的得率为15.52%。

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