伴肌动蛋白相关锚定蛋白特异性siRNA 筛选及效能评价*

张竞 张颖 王良哲 孙其志 袁文*

后纵韧带骨化症（ossification of posterior longitudinal ligament,OPLL）是发生于脊柱后纵韧带组织的异位骨化性疾病，最常见于颈椎部位。骨化物形成后可压迫脊髓和神经，产生感觉、运动功能障碍，严重者可致截瘫。OPLL 在东亚人种中常见：日本人发病率最高，为1.9%~4.3%；中国人为1.6%~1.8%[1]。OPLL的病因至今仍不明确，因而目前临床上缺乏有效的预防和抑制措施，其治疗主要为手术切除骨化物以改善神经功能障碍[2]。

既往研究表明，应力刺激是是骨化发展的重要因素[3,4]。OPLL患者韧带成纤维细胞（OPLL细胞）在应力刺激下可诱导成骨，同时表达多种成骨因子如骨桥蛋白、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP），转化生长因子-（Transforming growth factor beta,TGF-）等，相关受体的RNA转录也增强，进而出现细胞分化、基质钙沉积，而正常韧带细胞对应力刺激没有这样的反应[3,5]。造成OPLL 细胞应力高敏现象的机制尚不明确。我们在前期研究中发现，OPLL 患者的后纵韧带组织中，伴肌动蛋白相关锚定蛋白（Nebulin related anchoring protein,NRAP）表达水平高于正常对照[6]。

NRAP 是一种细胞骨架蛋白，属于LIM 蛋白家族，具有在细胞和细胞外基质之间传导应力的作用，参与扩张性心肌病和小脑生理性老化的过程[7]。我们推测NRAP 参与应力诱导细胞骨化的过程，且很可能是造成OPLL 细胞应力敏感的原因，阻断NRAP 或可抑制OPLL 骨化灶的形成和发展。为明确NRAP 在OPLL 发生、发展中的作用机制，我们拟采用RNA 干扰技术，抑制人原代韧带成纤维细胞中的NRAP 表达，观察OPLL 细胞在应力作用下成骨的变化。在本研究中，我们拟筛选抑制NRAP表达的最有效基因序列，并检测转染复合物的细胞毒性，为进一步研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株

人颈椎后纵韧带原代成纤维细胞。

1.1.2 试剂

骨骼肌细胞生长培养基（Promocell）、DMEM、lipofectamine 2000 和Trizol（Invitrogen），RT-PCR 试剂盒（TaKaRa），SYBR Green PCR Master Mix（Toyobo），NRAP 一抗和二抗（Abcam）。

1.1.3 siRNA 设计合成

根据NRAP（Genbank 号：NC_000010.10）的序列，运用在线设计工具siSearch 和sFold 设计合成靶向NRAP 的siRNA，并交由上海吉玛制药技术有限公司合成，序列如下：

表1 特异性siRNA 位点、序列

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

人后纵韧带成纤维细胞取自颈椎前路手术切除的后纵韧带。PBS 清洗后，组织贴壁法培养，10%胎牛血清的DMEM 培养液。待组织块周围有大量细胞迁出后，去除组织块，0.25%胰酶消化细胞并转移至培养皿中继续培养，收集第3 代细胞用于实验。

1.2.2 转染效率测定

转染前一天，成纤维细胞接种6 孔板，接种浓度为105个细胞/mL，每孔1ml。隔天lipofectamine 2000（1 l 或1.5 l）与25、50、75mol/L 的siRNA 混匀形成转染复合物，将转染复合物200 l 加入6 孔板与800 l 培养基混匀后孵育。转染24 小时后，观察转染率。

1.2.3 细胞毒性测定

转染24 小时后加入MTT 溶液5g/L，孵育4 小时后终止培养，弃去上清，加入DMSO 溶解，酶联免疫法检测光吸收值（波长：490nm）。计算公式：细胞存活率/%=实验组光吸收值/对照组光吸收值×100%。

1.2.4 RT-PCR

提取组织总RNA，加入Oligo dT 1 l 混匀后70℃放置5 分钟，立即冰浴。采用RevertAidTM First strand cDNA Synthesei Kit试剂盒，按照试剂盒说明将mRNA 反转录成cDNA，-20℃下保存。取逆转录产物1 l，采用SYBRR Green Realtime PCR Master Mix 试剂盒，按照试剂盒说明书配成20 l 反应体系。PCR 产物选择1/10000，1/100000，1/1000000，1/10000000 浓度的稀释产物作为标准品模版，生成工作曲线，计算Ct 值。

1.2.5 Western Blot

常规ABC法抽提蛋白，变性后经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转移至聚乙烯二氟膜上，滤膜封闭2 小时，分别加入一抗（NRAP,1：1000；actin,1：5000）4℃过夜；洗膜3 次；二抗室温孵育1h；加发光剂ECL，曝光压片。拍照、BIOID 图像分析软件分析，计算条带的积分光密度值（ID），ID值为平均光密度值×面积。用积分光密度值相对比比较蛋白的表达。

1.3 统计学分析

SPSS13.0 分析数据。连续型变量的组间差异采用 检验，p<0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染效率

siRNA 相同浓度下，不同Lipofectamine 2000 的剂量对细胞存活率无明显影响（p>0.05）；Lipofectamine 2000 相同剂量下，50及75mol/L siRNA 的转染效率高于25mol/L 组（p<0.01），50 和75mol/L 组之间无差异（表2）。

表2 不同转染条件下的转染效率

2.2 细胞存活率

siRNA 相同浓度下，Lipofectamine 2000 的剂量对细胞存活率无明显影响（p>0.05）；Lipofectamine 2000 相同剂量下，25、50mol/L 组细胞存活率均达80%以上，而75mol/LsiRNA 组细胞存活率较低（p<0.05）（表3）。由此选定Lipofectamine 2000 1 l+siRNA 50mol/L 为最佳转染比例。

表3 不同转染条件下的细胞存活率

2.3 转染后成纤维细胞NRAP mRNA 的表达水平

转染24 小时后，NRAP siRNA 4 个组的mRNA 表达量与溶媒组（仅加Lipofectamine 2000）相比均有一定程度降低，分别为74%（Nrap-46）、82%（Nrap-47）、49%（Nrap-58）、54%（Nrap-10）其中siRNA47 抑制效果最为明显，见图1。

2.4 转染后成纤维细胞NRAP 的蛋白质表达水平

转染后24 小时，用Western blot检测Nrap-47 对成纤维细胞NRAP 表达的影响。结果表明：成纤维细胞的NRAP 表达被明显抑制（图2）。因此，Nrap-47 能特异性靶向抑制NRAP，导致NRAP 转录翻译下调。

图1 Real-time PCR 检测靶向NRAP 的siRNA 抑制效果

图2 Western blot 检测发现Nrap-47 对NRAP 表达有显著抑制效果

3 讨论

后纵韧带骨化症起病隐匿、病程漫长，由韧带出现仅CT 可见的微小钙化点到形成椎管占位60%以上的巨大骨块常经历数十年。由于无法阻断骨化现象发展，对于早期发现的无症状患者临床只能采取观察、避免外伤的方法；待患者出现神经症状后采用手术切除治疗。因而，明确韧带骨化进展的机制，寻找早期干预、治疗OPLL 的方法是该领域的研究热点。

既往研究表明，OPLL 具有一定的遗传背景。Ⅵ型胶原编码基因是已知的OPLL 发病相关基因[8]。OPLL 患者韧带成纤维细胞与正常韧带成纤维细胞相比，分泌、增殖活跃，更易诱导成骨，因而又被称为OPLL 细胞[9]。应力是OPLL 发生、发展的重要因素[5,9]。应力刺激可诱导OPLL 细胞转化成为成骨细胞，同时表达多种成骨因子如骨桥蛋白、BMP、TGF- 等，其受体的RNA 转录也增强，进而出现细胞分化、基质钙沉积，而普通细胞对应力刺激没有这样的反应[3,5]。这些现象说明OPLL 细胞对应力信号敏感，而造成OPLL 细胞的应力高敏现象的机制尚不明确。我们在前期对OPLL 患者韧带组织的蛋白质组学研究中发现，后纵韧带骨化组织中NRAP 表达增加[6]。而NRAP 具有在细胞及细胞外基质间传导应力的作用。因而，我们推测NRAP 参与了应力诱导OPLL 细胞成骨的过程。

NRAP是一种细胞骨架蛋白，含1175 个氨基酸，在小鼠特异表达于骨骼肌和心肌组织，在人体横纹肌、心肌、脑、前列腺中均有表达[7]，其C 端为Nebulin 相关重复序列，可结合肌动蛋白（actin）和粘着斑蛋白。N 端为富含半胱氨酸的LIM 域。NRAP 这一结构用以连接actin 和其他蛋白或结构，在肌细胞的具体作用是将肌动蛋白锚定于肌纤维膜表面，并将肌纤维张力传导到细胞外基质中[10]。在心肌组织中NRAP 是肌原纤维形成过程中-辅肌动蛋白、肌动蛋白组装的骨架结构，可被蛋白酶降解，与NMHC IIB 相互调节并分别作用于肌原纤维形成的不同步骤[11]。NRAP 在先天性心肌病模型—tropomodulin 转基因小鼠中表达上调，提示NRAP 有可能作为扩张性心肌病的早期标志[12]。对先天性心脏病的研究还表明，NRAP表达上调并不像既往认为是基因突变的结果，而是转录机制异常的结果[13]。NRAP 与细胞骨化的关系目前尚无研究。

我们拟通过RNA 干扰技术，抑制OPLL 细胞及普通成纤维细胞中NRAP 的表达，观察抑制后细胞在应力作用下的成骨情况变化，以明确NRAP 表达水平与OPLL 细胞应力敏感性之间的关系。通过抑制NRAP 蛋白表达，也许可以有效阻断OPLL细胞对局部应力的反应性成骨。在本实验中，我们对比研究了针对人NRAP 的4 条siRNA 对成纤维细胞中NRAP 表达的抑制效果，发现4 条siRNA 对NRAP 的表达均有不同程度的抑制作用，其中Nrap-47 的抑制效果最好，为进一步利用RNA干扰技术研究NRAP 在OPLL 发生发展中的作用打下了良好基础。

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