新型猪胶原基真皮支架血管化的实验研究

卞东会，陈铭锐，于仁义，刘本立，宋国栋

(1济南军区总医院，济南250031;2山东大学附属济南市中心医院)

特重烧伤患者的救治过程中，及早有效地覆盖大面积的皮肤缺损区是救治的重要问题。异体脱细胞真皮(HADM)在结构和功能上最为接近天然真皮，已在临床得到广泛的应用，证明其是一种安全和有效的真皮替代材料［1］。但是HADM造价高，供体来源有限，产业化生产困难，还涉及医学伦理学的相关问题，有潜在传播疾病的风险，也限制了它的临床应用。猪皮来源广泛，价格低廉，易于产业化生产。但经过动物和临床试用均表明，传统方法制备的猪脱细胞真皮(PADM)临床应用效果不佳，其存在的异种蛋白抗原可能是主要原因［2，3］。另外，理想的真皮替代物首先应具备良好的组织相容性，有利于宿主细胞的长入，这也是其植入体内后能迅速血管化的关键。如何降低免疫原性，提高其组织相容性是改良PADM的一个方向。针对目前异种脱细胞真皮存在的一些缺陷，山东大学化学工艺研究所研制出一种新型的猪胶原基真皮支架(PCDM)［4］。本课题组前期实验通过病理切片及扫描电镜对其组织结构进行观察;利用四甲基偶氮唑盐比色法评价其细胞毒性，实验表明PCDM符合植入人体生物材料的细胞毒性要求。本研究时间为2007年3月～2009年3月，我们将PCDM埋植于Wistar大鼠皮下，观察血管内皮细胞(VEC)在支架内部的黏附生长特性，以及血管化情况，分析其作为真皮支架的可行性，并提供改良真皮支架的思路，以期为生物医学领域提供良好的生物材料。

1 材料与方法

1.1 动物模型及处理 成年雄性Wistar大鼠24只(山东中医药大学动物实验中心)，体质量300～350 g，随机分为两组，每组12只，分别为HADM组和PCDM组。将大鼠用氯胺酮(100 mg/kg)腹腔注射麻醉后，电推备皮，3%碘伏消毒大鼠背部，在脊柱两侧分别做一个1.5 cm×1.5 cm大小的皮瓣，深及深筋膜。将PCDM(或HADM)分别剪成1.0 cm×1.0 cm大小，在大鼠的一侧埋置移植物后以3-0丝线将其固定于大鼠背部，将创缘皮肤原位缝合固定，无菌敷料包扎。另一侧原位缝合，作为假手术对照。两组大鼠单笼饲养。

1.2 HE染色及CD34、Ⅷ因子免疫组织化学染色在第3天、第7天、第2周、第4周每组分别随机取3只大鼠处死，观察大鼠创面的愈合及埋植的PCDM(或HADM)的变化。分别取出PCDM(或HADM)，进行HE染色及CD34、Ⅷ因子免疫组织化学染色，观察PCDM(或HADM)细胞浸润、胶原生长和血管化情况。

1.3 血管计数 不同的时相点取埋植后的PCDM(或HADM)进行免疫组织化学染色，于高倍镜(×400)下计数真皮浅层5个视野内的典型微血管(管壁较完整且管腔内含红细胞)数目，取平均值。

1.4 统计学方法 应用SPSS13.0软件进行 χ2检验和t检验，χ2检验使用Fisher's精确概率法，以P≤0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 大体观察 制备好的PCDM呈瓷白色，表面平整光滑，有皮肤纹理起伏感，当中有均匀分布的天然毛孔，柔韧易塑形(图1)。术后创口周围皮肤无明显红肿及炎症反应，1周时创缘基本愈合，2周时创缘完全愈合，4周时几乎看不清切口。术后4周手术区毛发生长好，与手术区外比较差别不大。术后14 d各组移植物质地稍硬，透过皮肤可以较容易地触及。切开观察移植物与周围组织相容性好，降解不明显。术后30 d切开取样检视时，可见埋入皮下的真皮移植物表面有丰富而清晰的血管网，移植物与创面接触紧密。其中部分有不同程度吸收退化，以HADM较明显，表现为面积缩小，厚度变薄等，个别甚至难以辨认。

图1 PCDM的大体形态

2.2 组织学观察

2.2.1 HE染色观察 术后3 d各组真皮替代物内可见成纤维细胞(FB)侵入，中性粒细胞、淋巴细胞及少量巨噬细胞浸润。各移植物与周围组织连接处可见开始增生的细小新生毛细血管芽(封三图2、3)。术后7 d时，各移植真皮内可见新生毛细血管向移植物内部延伸。术后14 d各组移植物与受床周围组织界限清楚，组织内见VEC增生，新形成的毛细血管多分布于靠近受床组织处，少数达移植物内部;组织中可见少量的中性粒细胞、淋巴细胞浸润(封三图4、5)。术后30 d，移植物内血管进一步成熟，并分布到移植物内各处。FB数目减少，胶原纤维增多，各组真皮与受床的界线仍较清楚，原有网架结构的清晰可见(封三图6～8)。未见明显的炎性细胞。

2.2.2 免疫组织化学染色 兔抗鼠CD34及Ⅷ因子分别对VEC胞质阳性着色(封三图9)。PCDM组与HADM组在移植后的血管化进程、VEC的增生、迁移和数量变化上无明显区别。

2.2.3 血管化速度 PCDM移植后3 d即有VEC浸润生长，偶可见血管增生灶，内部未见明显血管增生。7 d时，微血管可达PCDM真皮浅层，VEC幼稚，管腔小，管壁薄。血管数量与HADM比较未见统计学差异(P＞0.05)。14 d时，血管已迁入真皮支架内部，数量明显增多，VEC较成熟，管腔变大，管壁增厚，与7 d时比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。30 d时，血管进一步成熟，血管结构完整，管腔大，管壁厚，VEC细长，但血管数量未见明显增多，与14 d时比较，无统计学差异(P＞0.05)。各个时相点，两组之间比较均无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 不同的时相点毛细血管计数比较(¯x±s)

3 讨论

FB在组织工程皮肤中有着深远的意义。有研究表明，胶原凝胶中混合一定量的FB于体外培养可增强该真皮支架的机械强度及耐酶解作用［5］。而在尼龙网上种植新生儿包皮FB后，可促进血管侵入生长，并减少对尼龙、硅胶等异物的炎性反应［6］，因此，真皮替代物中快速广泛的长入FB，可提高生物亲和性，加速新生血管形成。但对其具体机制尚不清楚，一般认为，FB作为真皮组织中主要的细胞成分，具有较高的生物学活性，可分泌多种细胞因子、生长因子和细胞外基质成分，从而增强真皮替代物的亲和性，促进血管化［7］。皮肤全厚缺损的愈合，真皮层和上皮层成分的广泛合成和改建，其中FB在这种过程中起着重要的作用。因此提高真皮替代物的组织相容性是真皮替代物改良的重要方向。

我们的实验通过组织学观察到，PCDM移植后3 d即有FB、VEC浸润生长，偶可见血管增生灶，内部未见明显血管增生。7 d时，各移植真皮内可见大量FB侵入、增生，沿胶原纤维方向分布，微血管可达PCDM真皮浅层，VEC幼稚，管腔小，管壁薄。血管数量与HADM比较未见明显差异。14 d时，各组移植物与受床周围组织界限清楚，组织内见较多FB浸润和VEC增生，新形成的毛细血管多分布于靠近受床组织处，少数达移植物内部，数量明显增多，VEC较成熟，管腔变大，管壁增厚，与7 d时比较，差异有统计学意义。30 d时，FB数目减少，胶原纤维增多，排列规则，各组真皮与受床的界线仍较清楚，原有网架结构的清晰可见，血管进一步成熟，血管结构完整，管腔大，管壁厚，VEC细长，但血管数量未见明显增多，与14 d时比较无统计学差异。各个时相点，HADM、PCDM之间比较均无统计学差异。因此，PCDM可诱导宿主FB及毛细血管有序长入，并可改造新生的真皮基质。实验证明，本组PCDM有着良好的组织相容性。

我们以往通过对FB在PCDM真皮乳头层和真皮网状层的培养发现［8］:虽然在细胞种植早期乳头层面有利于FB的黏附，但晚期却成为FB进一步增殖并向真皮基质深部渗透的障碍，因此保留乳头层的PCDM植入体内，势必影响其血管化进程和宿主细胞的长入。另外，真皮乳头层是异种抗原最易残留的区域。Desagun等［9］用抗猪ADM抗血清进行IHC实验，ADM内的Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白不发生反应，而基底层区域反应最强，由此认为基底层Ⅳ型胶原或层黏连蛋白是猪ADM抗原的主要来源。Ninomiya［10］亦指出基底膜Ⅳ型胶原中 α(Ⅳ)NCL结构域有明显的抗血管生成活性，因此去除基底膜及致密的乳头层既可以提高PCDM的组织相容性，也能降低抗原性。如果将PCDM用于组织填充或联合带有基底膜的自体刃厚皮移植，完全可以去除乳头层;若作为组织工程皮的真皮模版体外构建复合皮，去除乳头层面时要慎重，这样会降低种子细胞早期的黏附率，去除真皮乳头层同时改良工艺，对PCDM表面修饰来提高其早期的细胞黏附性将是最好的选择。

ADM的基本结构是胶原网架，胶原分子的三股螺旋结构非常稳定，不为一般蛋白酶水解，但可为胶原酶水解，胶原的降解较慢，半寿期为数周至数年不等。在动物，静止的真皮结缔组织中没有胶原酶，但在创伤愈合过程中新形成的间叶组织中则具有胶原酶，通过胶原酶的作用，胶原降解、溶解，后被吸收;FB是组织中胶原酶的主要来源，在结缔组织的分解代谢过程中起关键性作用［11］。另外，胶原还可被新生的VEC溶解。机体通过胶原合成和胶原降解吸收，对组织进行改造［12］。本实验取材中发现，ADM移植后4周稍有缩小。镜下观察，虽然长入ADM中的FB已产生新胶原纤维，但ADM中原有的胶原网架结构仍非常清晰。我们推测这种吸收可能是正常的组织改建。关于ADM移植后的降解改建、新生胶原的亚型及其比例是否接近于正常皮肤等问题，尚有待于进一步研究。

综上所述，PCDM具有较好的组织相容性。人FB、VEC在PCDM上增殖良好，细胞能够广泛迁入支架内部，血管化好，虽然迁入的数量和深度有限，但足以说明不存在异种抗原阻碍人FB向真皮内部的渗透，可能是胶原结构方面的缺陷使FB不能大量而广泛的迁入，提示结构改良有助于提高其细胞相容性。在细胞种植的早期，真皮支架的乳头层较网状层更有利于FB的黏附，但晚期乳头层却成为FB进一步增殖并向真皮基质深部渗透的障碍，因此去除真皮乳头层有助于提高异种真皮替代物的组织相容性，但网状层真皮表面需要进一步修饰以提高细胞早期的黏附率。本实验是对这种新型PCDM的安全性和组织相容性的初步研究，进一步揭示其结构和成分以及进一步的结构改良和临床应用尚需要多次的体外实验和动物体内实验来协助完成。

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