脑钠尿肽基因rs198389单核苷酸多态性与冠心病的相关性研究

蕾茹，江小青，汪里萍，肖卫，刘黄军

(荆州市第一人民医院心内科，湖北荆州434000)

·论著·

脑钠尿肽基因rs198389单核苷酸多态性与冠心病的相关性研究

蕾茹，江小青，汪里萍，肖卫，刘黄军

(荆州市第一人民医院心内科，湖北荆州434000)

目的探讨脑钠尿肽(BNP)基因rs198389位点单核苷酸多态性(SNP)与冠心病(CHD)的关系。方法取病例-对照方法，收集冠心病和健康者各961例，应用Real-time qPCR(TaqMan探针)技术进行基因分型，分析BNP基因rs198389位点SNP与CHD危险性的关系。结果CHD组和对照组比较，AA和GG基因型、A等位基因和G等位基因分布差异有统计学意义(P＜0.05)；GG基因型和G等位基因频率在病例组(3.6%和16.7%)明显高于对照组(2.1%和14.3%)。与A等位基因比较，G等位基因使CHD危险性显著增加(OR=1.20，95%CI=1.01～1.43，P=0.04)。GG基因型者CHD危险性增加(P=0.04)，但在调整年龄、性别、吸烟、饮酒、体重指数、血甘油三脂、高血压史、糖尿病史和CHD家族史等变量后结果差异无统计学意义(P=0.12)。结论BNP基因位点rs198389的G等位基因使CHD危险性显著增加；BNP基因rs198389位点SNP可能与CHD易感性相关，但不是其独立危险因素。

脑钠尿肽；单核苷酸多态性；冠心病

冠心病(CHD)的发生与基因遗传易感性有关。脑钠尿肽(BNP)有维持机体循环系统和内环境稳定的作用，通过多种机制参与CHD的发生发展，BNP基因可能成为一种与CHD危险相关的候选基因。本研究对BNP基因的rs198389位点单核苷酸多态性(SNP)与CHD的关系进行初步探讨。

1 资料与方法

1.1 临床资料研究采用病例-对照设计。病例组和对照组各961例，为湖北地区无血缘关系的汉族人群。采用修订后的Inter-heart调查表进行流行病学调查，所有研究对象均签署了知情同意书。CHD诊断依据WHO诊断标准[1]或经冠脉造影显示有一支或一支以上冠脉狭窄≥50%者(CHD组)。对照组为常规体检健康者。心血管危险因素判断：高血压[收缩压≥140 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)和(或)舒张压≥90 mmHg或目前正在服用降压药物]、糖尿病(空腹血糖≥7.0 mmol/L，餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L或目前在服用降糖药物)、CHD家族史(父母中有CHD患者)、吸烟(平均每天至少吸1支，并且连续吸烟≥1年，包括现在吸烟或以前吸烟但已经戒烟达到一年以上者)、体重指数(体重指数=体重(kg)/身高(m)2，19～24为正常)。

1.2 方法

1.2.1 临床参数检测每位对象均于空腹12 h后抽取外周静脉血，全自动生化分析仪测定总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、空腹血糖和肌酐。

1.2.2 基因扩增和分型抽取外周静脉血6 ml，注入EDTA-K2抗凝离心管，摇匀。按PUREGENE DNA提取试剂盒说明书进行DNA抽提。测定和稀释(GENTRA公司Puregene试剂盒)DNA至终浓度为5～10 ng/μl。基因分型采用Real-time qPCR技术，探针(TaqMan探针)、引物和基因分型试剂盒由ABI公司提供，按公司推荐的反应体系和条件在ABI-7900荧光定量PCR仪上进行PCR和终点读板分析。Rs198389位点2条探针分别由FAM和VIC这2种荧光标记，上游引物序列5'-GTCTCCCGCTTCTTCCTTTCC-3'，下游引物序列5'-CAGGAAGAAAGCGCCAACCTA-3，探针序列为FAM-AAATGTCCGGGTGTCC-NFQ，VIC-CAAATGTCCAGGTGTCC-NFQ。A等位基因由VIC(绿色)荧光标记，G等位基因由FAM(红色)荧光信号标记，两个反应体系中均以ROX(黄色)荧光为参比。绿色曲线表示纯合子AA基因型，红色曲线表示纯合子GG基因型，绿色和红色双曲线表示杂合子AG基因型。不同基因型的聚类分析：红色表示AA基因型，兰色表示GG基因型，绿色表示AG基因型。利用SDS 2.2.1软件分析TaqMan基因分型结果。

1.3 统计学方法应用SPSS10.0软件包统计分析。在本研究中所有计数资料用卡方检验；计量资料以均数±标准差(x-±s)表示，用独立样本t检验比较，首先进行方差齐性检验，以P＞0.05为方差齐性，进行t检验，方差不齐者采用非参数检验。采用非条件Logistic回归模型判断CHD危险因素作用的大小。混杂因素的控制采用多元逐步Logistic回归模型分析，计算主要危险因素的调整OR和95%CI。以OR的95%CI不包含1为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组临床资料比较CHD组男性693例，女性268例，平均年龄(59.73±10.13)岁；对照组男性673例，女性288例，平均年龄(59.73±9.78)岁，两组间年龄和性别比较差异无统计学意义。CHD组中吸烟、空腹血糖、收缩压水平、高血压史、糖尿病史和CHD家族史显著高于对照组，而饮酒史显著低于对照组，见表1。两组舒张压[(81.67±14.33)mmHg和(82.20±11.00)mmHg]和体重指数[(24.31±3.58)和24.30±3.24)]比较差异无统计学意义(P＞0.05)。总胆固醇水平对照组明显高于CHD组[(5.07±1.31)mmol/L和(4.48±1.02)mmol/L，P＜0.05]，甘油三酯在两组间比较差异无统计学意义[(1.70±1.1)mmol/L和(1.70± 1.37)mmol/L，P＞0.05]，这可能与CHD组使用他汀类调脂药治疗干预有关。

2.2 两组基因型和等位基因频率分布经卡方检验，各基因型在总人群、CHD组和对照人群中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡规律(χ2值分别为1.16、1.57和0.00，P值分别为0.56、0.455和1.00)，说明本试验人群的rs198389基因分布可反映整体人群的基因分布情况。总研究人群基因分布与美国国立生物技术信息中心(NCBI)公共数据库提供的中国人群基因分布数据对比，差异无统计学意义(P＞0.05)。在CHD组和对照组之间，AA和GG基因型分布、A等位基因和G等位基因频率差异有统计学意义，其中，GG基因型和G等位基因频率在CHD组明显高于对照组(P＜0.05)，见表2。

表1 CHD组和对照组心血管危险因素比较

表2 两组rs198389基因型和等位基因分布[例(%)]

2.3 BNP基因rs198389多态性与CHD的关联性采用非条件Logistic回归分析。与A等位基因相比，G等位基因使CHD危险显著增加(OR=1.20， 95%CI=1.01～1.43，P=0.04)。单因素分析时GG基因型者CHD危险显著增加(OR=1.83，95%CI=1.05～3.20，P=0.04)。在调整年龄、性别、吸烟、饮酒、体重指数、血甘油三酯、高血压史、糖尿病史及CHD家族史等变量后，GG基因型与CHD危险增加比较差异无统计学意义(OR=1.63，95%CI=0.89～3.00，P=0.12)，各值见表3。

表3 BNP rs198389基因多态性与CHD的相关性

2.4 多元逐步Logistic回归模型分析结果CHD主要影响因素依次为高血压史、糖尿病史、吸烟、CHD家族史、饮酒和性别，其中高血压史、糖尿病史、吸烟、CHD家族史和性别(男性)使CHD危险显著增加，而饮酒使其下降。基因型没有被纳入回归模型最后步骤，提示BNP基因rs198389基因型可能不是CHD的独立危险因素，见表4。

表4 CHD主要影响因素Logistic回归模型

3 讨论

脑钠尿肽即B型利钠肽属于多肽类激素家族，可能通过抑制内皮细胞功能、抗纤维化、抑制心肌细胞及血管平滑肌细胞的增殖、介导脂解作用等参与CHD的发生、发展，其临床应用价值越来越受到重视。

CHD是一种环境和遗传因素共同作用而导致的常见疾病，近年来关于CHD遗传易感性相关基因的研究成为热点。人的BNP与ANP基因呈串联排列，位于1号染色体上(1p36.2)，含有3个外显子和2个内含子，编码BNP激素原前体[2]。不同于ANP的分泌主要受激素分泌水平调控，BNP直接受到基因表达转录水平的调控[3]。因而，BNP基因多态性可能影响BNP基因表达活性或蛋白质功能。BNP基因rs198389位点位于基因5'端启动子区，其SNP可能对基因启动子活性产生直接影响，从而影响BNP基因表达，进一步作用于CHD的疾病过程。在蛋白质水平上，关于BNP与CHD的研究很多。PREVEND研究显示，NT-proBNP水平与心血管事件发生率显著相关，NT-proBNP水平每升高一倍使全因死亡率增加22%和心血管事件风险增加16%，认为NT-proBNP是死亡风险和心血管事件风险强有力的预测因子[4]。检测BNP水平可用急性冠脉综合征危险分层[5]。在基因水平上，BNP与CHD的研究国内外报道较少，近期有几个关于BNP基因rs198389与疾病相关性的研究。冠状动脉旁路移植术基因组试验(The CABG Genomics Study)对7个相关基因139个SNPs进行分析发现，NPPA/NPPB基因7个位点SNPs与CABG术后心衰风险降低有关，其中包括rs198389位点，其次要等位基因与CABG术后心衰发生率降低显著相关[6]。并且认为等位基因编码的BNP质和量发生变化后，通过自分泌和旁分泌作用于心室肌，减轻术后心衰的发生[7]。Ellis等[8]发现NPPB基因位点rs198389的次要等位基因显著升高血BNP和NT-proBNP水平，使舒张早期二尖瓣血流速度与二尖瓣环运动速度比值、左心室收缩末期容积指数和左心室舒张末期容积指数显著减少，降低以心血管事件原因的再次住院率，认为BNP基因对心血管有保护作用。但也有临床试验发现基因多态性与疾病临床情况无关联，Costello-Boerrigter等[9]发现BNP基因rs198389多态性与心血管表型或生存率无显著相关。研究结果的不同可能与试验对象、方法和样本量不同有关。

本研究发现BNP基因上5'端启动子区rs198389位点多态性与CHD危险性相关。等位基因G显著增加CHD危险，GG基因型在单因素分析时使CHD危险性显著增加，提示该位点多态性可能成为CHD的一种遗传易感性标志物。本研究还显示在调整性别、年龄、吸烟、饮酒、体重指数、血甘油三脂、高血压和糖尿病史、CHD家族史等混杂因素后，GG基因型与CHD危险的关联性差异无统计学意义，这可能与CHD的遗传机制呈多种微效基因积累作用模式有关，也可能是BNP基因rs198389位点在人群中突变率低(GG基因型为3.6%)影响了统计学意义。CHD病因学的复杂性决定了可能并不存在明显的主效基因，因而单个微效基因多态性可能与CHD关联不显著。研究显示不同基因多态性有协同作用[10]，因此，CHD的遗传易感性研究需选择多个候选基因，同时检测多个基因多态性，综合分析整体影响。

总之，钠尿肽基因多态性分析进一步提高了对疾病分子学机制的理解，对研究CHD风险人群的筛查、个体化预防、诊断和治疗具有重要的意义，但尚需符合遗传学研究统计要求的大样本及多基因多态性联合研究及重复验证。

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Association between single nucleotide polymorphism rs198389 in brain natriuretic peptide gene and coronary heart disease.

LEI Ru,JIANG Xiao-qing,WANG Li-ping,XIAO Wei,LIU Huang-jun.Department of Cardiology,the First People's Hospital of Jingzhou,Jingzhou 434000,Hubei,CHINA

ObjectiveTo investigate the association between single nucleotide polymorphism rs198389 in-brain natriuretic peptide(BNP)gene and coronary heart disease(CHD).MethodsPatients with CHD(the CHD group,n=961)and 961 healthy subjects(n=961,the control group)were enrolled in this study.The BNP rs198389 polymorphism was genotyped by real-time quantitative polymerase chain reaction(Real-time qPCR).The association between BNP rs198389 polymorphism and CHD was analyzed by SPSS10.0 software.ResultsThere was statistically significant difference in the distribution ofAAand GG genotypes between the CHD group and the control group(P＜0.05).The frequencies of GG genotype and G allele were significantly higher in CHD group(3.6%and 16.7%)than in the control group(2.1%and 14.3%).G allele carries significantly higher risk of CHD thanA allele(P=0.04).GG genotype presented a significantly higher risk of CHD(P=0.04),but this risk was not more significant when adjusted for CHD risk factors by unconditional Logistic regression analysis(P=0.12).ConclusionThe G allele of BNP gene rs198389 site significantly increased the risk of CHD.The results suggest that BNP gene rs198389 may be a susceptibility gene of CHD,but it is not independent risk factor.

Brain natriuretic peptide;Single nucleotide polymorphism;Coronary heart disease

R541.4

A

1003—6350（2013）09—1258—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.09.0532

2012-12-13)

肖卫。E-mail：99xw@sina.com