PCR联合RDB技术检测β-地中海贫血基因结果分析

梁汉彰

(深圳市盐田区人民医院检验科深圳市第七人民医院，广东深圳518081)

PCR联合RDB技术检测β-地中海贫血基因结果分析

梁汉彰

(深圳市盐田区人民医院检验科深圳市第七人民医院，广东深圳518081)

目的探讨PCR联合RDB技术检测β-地中海贫血基因的特异性和敏感性。方法选取在我院体检的50例β-地中海贫血基因携带者，随机分为两组各25例，对照组采用RDB技术检测，观察组利用PCR联合RDB技术检测β-地中海贫血基因携带者标本，比较两组患者的检测结果并进行统计学分析其特异性和敏感性。结果观察组患者在β-地中海贫血患者中，有11例患者β41-42(-TCTT)发生突变，约占44%，6例患者IVS-Ⅱ654(C→T)，约占24%，还有3例患者β17(A→T)发生改变，约占12%；TATA盒-28(A→T)的有2例，约占8%；β 71-72(+A)者1例，占4%；无法检测的有2例，约占8%。对照组检测率分别为32%、16%、12%、4%、8%和28%，两组相比，差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论PCR联合RDB技术检测β-地中海贫血基因与单用RDB技术检测相比较具有更高敏感性、特异性；同时联合检查具有高通量和快速的特点，可同时检测5个已知突变或未知突变；此外联合检查还可以进行质量控制，与传统检测方法相比具有成本低的优势。

β-地中海贫血；基因；PCR技术；RDB技术

β地中海贫血是我国南方地区，特别是广东、广西地区高发的单基因遗传病之一，高发人群携带率达3%~10%，其分子病理学基础主要为β-珠蛋白基因的点突变、缺失和插入[1]。在深圳市特别是盐田区，地中海贫血基因携带率达10.3%，其中β-地中海贫血基因携带率达3.4%[2]。患重型β-地中海贫血患者目前尚无理想治疗手段，只能通过定期输血治疗等维持生命，但由于经济等原因很多人根本无法进行骨髓移植等更高费用的治疗。因此，只有通过婚检和产前检查，筛查无症状地中海贫血基因携带者，才能将患病儿童出生率降到最低。

目前临床传统应用的反向点杂交技术(Reverse dot blot，RDB)检测β-地中海贫血存在检测费用高，周期长，可能出现假阴性等缺点。近年来建立并得以迅速发展的PCR联合RDB技术可自动检测单碱基替代及小片段核苷酸的插入或缺失，它已被证实为高性价比的检测技术[3]。本研究采用PCR联合RDB技术对β-地中海贫血基因携带者进行检测，以探讨其特异性和敏感性，现将结果报道如下：

1 资料与方法

1.1 临床资料选取2009年1月至2012年12月在我院体检的β-地中海贫血基因携带者标本50例，随机分为观察组和对照组各25例。对照组中男性16例，女性9例，年龄23~43岁，平均(31.4±4.1)岁。观察组中男性17例，女性8例，年龄21~42岁，平均(30.8±4.2)岁。两组患者的年龄、性别、文化程度、生活习性差异无统计学意义，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 主要仪器与试剂DA7600荧光定量PCR仪、DYY电泳仪、蛋白凝胶分析系统等主要仪器；α、β-地中海贫血基因诊断试剂盒；DNA提取液等。

1.2.2 检测方法[4]50例地中海贫血筛查阳性者，对照组25例采用反向点杂交(RDB)技术方法；观察组25例采用PCR结合RDB技术作基因诊断，确定地中海贫血基因缺失和点突变类型。同时对对照组患者的标本进行PCR联合RDB第二次检测。

1.3 统计学方法所有数据均采用SPSS11.0软件分析，计数资料采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者不同检测方法基因突变检测率比较观察组有11例患者β41-42(-TCTT)发生突变，约占44%，6例患者IVS-Ⅱ654(C→T)，约占24%，还有3例患者β17(A→T)发生改变，约占12%；TATA盒-28(A→T)的有2例，约占8%；β71-72(+A)者1例，占4%；无法检测的有2例，约占8%。而对照组单纯的使用RDB检测，检测率为72%，远低于观察组的92%，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 两组患者基因突变检测情况比较[例(%)]

2.2 对照组患者两种方法检测前后比较对照组患者的标本在使用RDB技术检测后，再对标本进行PCR联合RDB技术检测，结果发现，RDB技术检测假阴性率较高，特异性较低，与联合检测比较，差异具有统计学意义，见表2。

表2 对照组患者两种检测方法检测前后比较[例(%)]

2.3 两组患者检测时间和费用比较由于对照组每次检测只能一个标本一次检测，标本同时进行检测，而PCR联合后先对样本进行电泳杂交，然后批量检测，为对照组的10倍，大大节省了检查的时间和成本。为患者早期的诊断和治疗带来了便利。

3 讨论

地中海贫血又称海洋性贫血，是一组遗传性疾病。其发病机制是合成血红蛋白的珠蛋白链减少或缺失导致血红蛋白结构异常，从而导致红细胞变形，寿命缩短，并且可以提前被人体的肝脾等破坏，导致贫血甚至发育等异常。目前研究发现β-地贫基因突变较多，迄今已发现的突变点达100多种，国内已发现28种。其中常见的突变有6种[5]：①β41-42(-TCTT)，约占45%；②IVS-Ⅱ654(C→T)，约占24%；③β17(A→T)；约占14%；④TATA盒-28(A→T)，约占9%；⑤β71-72 (+A)，约占2%；⑥β26(G→A)，即HbE26，约占2%。

DHPLC对基因突变的筛查，是应用离子反向液相色谱技术，通过独特的DNA分离基质，对特定的PCR扩増产物进行分离[6-7]。由于该技术具有准确、敏感、高通量、自动化的特点，已被临床广泛应用于基因诊断。该技术检查可普及370多个基因[8]，目前研究显示，其可成功筛选出早期乳腺癌、卵巢癌相关基因(BRC A1)的突变[9]，其功能被不断开拓，已用于基因变异、细菌鉴定[10]等多方面应用。

本研究对对照组采取两份样本，一组采用RDB技术进行检测，同时对另一份标本进行PCR联合RDB检测。将研究结果与目前临床传统应用的RDB进行分析比较，结果发现PCR联合RDB检测技术在β-地中海贫血基因携带者检测方面具有较高的特异性和敏感性，而单用RDB技术检测时CDs41-42 (-TCTT)出现假阴性率为16%，IVS-2-654(C→T)假阴性率为8%，TATAbox-28(A→G)假阴性率为4%，且RDB检测时间长，每次只能一个标本检测。而PCR联合后先对样本进行电泳杂交，然后批量检测，大大节省了检查的时间和成本[11]。

综上所述，PCR联合RDB技术检测β-地中海贫血基因与RDB技术相比较具有更高敏感性、特异性，同时具有高通量和快速的特点，并可同时检测5个已知突变，并可以检测未知突变，同时还可以进行质量控制，与传统检测方法比较具有成本低的优势。因此更能让患者接受。

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[4]Lilleberg SL.In-depth mutatuin and SNP discovery using DHPLC gene scanning[J].Curr Opin Drug Disco Dev,2003,6(2):237-252.

[5]吴柏林,朱建中.变性高效液相色谱基因扫描技术在人类疾病基因诊断中的应用[J].中华医学遗传学杂志,2004,21(5):530-535.

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[9]范联,林业辉,周杏,等.佛山地区地中海贫血基因型的调查研究[J].中华全科医学,2013,11(4):593-594.

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[11]张宏秀,单可人,惠春林,等.应用PCR-RDB技术对B地中海贫血进行快速产前基因诊断[J].中华围产医学杂志,2002,5(4): 248-251.

Effect of PCR combined with RDB in the detection of β-thalassemia gene.

LIANG Han-zhang.Department of Clinical Laboratory,Shenzhen Yantian District People's Hospital(the Seventh People's Hospital of Shenzhen City), Shenzhen 518081,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo study the specificity and sensitivity of detecting β-thalassemia gene by PCR combined with RDB.MethodsFifty β-thalassemia gene carriers collected in our hospital were randomly divided intotwo groups.The control group(n=25)applied RDB technology for detection,while the observation group(n=25)used PCR and RDB for detection of β-thalassemia gene carriers.The detection results of the two groups were compared and statistically analyzed.The specificity,sensitivity were analyzed.ResultsOf these patients in the observation group, 11(44%)cases were β41-42(-TCTT),6(24%)cases were IVS-Ⅱ654(C→T),3(12%)cases were β17(A→T),2 (8%)cases were TATAboxes-28(A→T),1(4%)case was β71-72(+A),and 2(8%)cases were not detected,which were 32%,16%,12%,4%,8%and 28%in the control group.The specificity and sensitivity of PCR combined with RDB technology were higher,compared with RDB detection technology.ConclusionCompared with RDB,PCR combined with RDB in the detection of β-thalassemia gene has higher sensitivity,specificity,which is fast and with high throughput.It can simultaneously detect five known mutations or unknown mutation.Besides,it is easy for quality control,and has the advantages of low costs.

β-thalassemia;Gene;PCR;RDB

R556.6+1

A

1003—6350（2013）16—2403—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.16.0991

2013-03-28)

深圳市盐田区科技计划项目(编号：200761211)

梁汉彰。E-mail：lhz@163.com