三种痰涂片前处理方法的染色及消毒效果评价

谢爱蓉，吕建新

（温州医学院 检验医学院，浙江 温州 325035）

结核病对医务人员的职业危害不可忽视，实验室工作人员结核患病风险为普通人群的7～79倍[1]。抗酸杆菌涂片镜检作为发现传染源、选择化疗方案、考核评价疗效的重要手段，在现代结核病控制工作中占有不可或缺的位置。所以在不影响涂片染色镜检的情况下，将涂片中的分枝杆菌灭活，对于提高基层实验室生物安全有重要意义。本实验利用紫外线照射、次氯酸钠溶液消毒及高压蒸汽灭菌三种方法对痰涂片进行前处理，用以灭活分枝杆菌，观察其效果。

1 材料和方法

1.1 材料 73份新鲜抗酸染色阳性痰液由温州市鹿城区人民医院痰检实验室提供。次氯酸钠消毒液、抗酸染色液分别购自杭州西子卫生消毒药械有限公司、杭州嘉伟生物制品有限公司。改良罗氏培养基按照《结核病诊断实验室检验规程》[2]自制。

1.2 方法

1.2.1 痰液处理及分组：痰液充分震荡匀化，确保细菌的均匀分布，然后分为四份，分别用于对照组、紫外线照射组、次氯酸钠溶液消毒组及高压蒸汽灭菌组。

1.2.2 各组处理：

1.2.2.1 对照组：采用直接涂片方式，取40μL痰液在涂片中央处均匀涂抹成10 mm×20 mm的椭圆形痰膜，制作两张涂片：一张进行抗酸染色，作为镜检对照；一张经火焰固定后刮取痰膜，放入含1 mL 0.9%氯化钠溶液的试管中浸泡，并加入等体积4% H2SO4，强烈振荡，静置20 min后培养。剩余痰液采用分枝杆菌分离培养酸处理方法[2]消化去污，作为培养对照。

1.2.2.2 紫外线照射组：将涂片置于LABCONCO B2生物安全柜内，用辐照度值为332～360μw/cm2的紫外灯分别垂直照射（距离58 cm）10、20、40、60、80 min后，同火焰固定培养操作处理，刮取痰膜培养。

1.2.2.3 次氯酸钠溶液消毒组：将痰液分为两小组，向痰液中加入等量有效氯浓度50 g/L次氯酸钠溶液处理10～15 min后，一组加入等量的蒸馏水混匀，以2500 r/min速度离心15 min，取沉淀；一组加蒸馏水至15 mL混匀，室温中静置过夜（15～18 h），取沉淀。

1.2.2.4 高压蒸汽灭菌组：将痰液放入高压蒸汽灭菌锅中（压力103.4 kPa，温度121 ℃），灭菌20 min。以2500 r/min速度离心15 min，取沉淀。

1.2.3 抗酸染色镜检：将处理后的各组痰液，采用对照组涂片方式制作涂片，然后进行萋-尼氏抗酸染色及镜检分级报告[2]。

1.2.4 分枝杆菌培养与报告：将处理后的各组痰液，取100μL无菌接种于改良L-J培养基，37 ℃温箱培养，参照《结核病诊断实验室检验规程》[2]方法观察并报告结果。

1.3 统计学处理方法 使用SPSSl6.0统计学软件，采用Friedman M检验各组萋-尼染色镜检结果分级差异，然后用Wilcoxon符号秩和检验进行两两比较；logistic回归分析杀菌效果与痰液含菌量、紫外线照射时间之间的关系，用x2线性趋势检验菌量与杀菌效果间的关系。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 抗酸染色镜检比较 各组镜检结果分级存在差异（P＜0.05）。73份痰液，对照组结果为抗酸杆菌阳性（1～8条/300视野）8份，抗酸杆菌阳性（1+）6份，抗酸杆菌阳性（2+）18份，抗酸杆菌阳性（3+）11份，抗酸杆菌阳性（4+）30份。经紫外线照射后，镜检结果分级及涂片上结核菌的染色性、形态均未发生改变，与对照组相同。次氯酸钠溶液消毒组（沉淀法、离心法）镜检结果低于对照组（P＜0.05），见表1-2。次氯酸钠溶液消毒组中沉淀法与离心法镜检结果差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。高压蒸汽灭菌组镜检结果分级高于对照组（P＜0.05），见表4，但其中一张涂片因痰膜脱落，无法镜检。在抗酸染色镜检效果上，次氯酸钠溶液消毒组及高压蒸汽灭菌组镜下没有黏液及细胞的干扰，背景较单一、干净。

2.2 分枝杆菌培养结果 培养对照结果为涂阳培阳65份，涂阳培阴5份，污染3份。各组分枝杆菌培养结果比较采用培养对照涂阳培阳的65份样本。火焰固定后培养结果与培养对照相同。紫外照射组，随着紫外线照射时间的延长，培养阴性涂片数逐渐增多，当辐照60 min后，所有涂片分枝杆菌培养均为阴性。经logistic检验，分枝杆菌培养结果与涂片含菌量、紫外线照射时间有显著相关性，P＜0.05，见表5。要达到杀灭分枝杆菌的目的，菌量越多，培养阴性所需照射时间越长。辐照强度、照射时间相同的情况下，菌量与培养阳性比例存在线性趋势，P＜0.05，见表6，说明菌量越多，培养阳性比例越大，即杀菌效果越差。次氯酸钠溶液消毒组分枝杆菌培养均为阴性。

表1 次氯酸钠溶液沉淀法与对照组抗酸染色镜检结果分级比较

表2 次氯酸钠溶液离心法与对照组抗酸染色镜检结果分级比较

表3 次氯酸钠溶液沉淀法与离心法抗酸染色镜检结果分级比较

表4 高压蒸汽灭菌组与对照组抗酸染色镜检结果分级比较

表5 不同菌量的涂片经紫外线照射不同时间的培养结果

表6 不同菌量的涂片照射相同的时间（10 min）后的培养结果

3 讨论

本实验中火焰固定后的涂片培养均为阳性，说明火焰固定并不能杀死涂片上的分枝杆菌。所以涂片在未染色前，应进行灭活处理，以减少实验室生物安全危险因素。本实验采用紫外线照射消毒、次氯酸钠溶液消毒及高压蒸汽灭菌三种方法对痰涂片进行前处理，用以灭活涂片中的分枝杆菌。

结果显示紫外线照射不影响涂片抗酸染色镜检，当紫外线辐照剂量达到1195200～1296000 μw·s/cm2时，培养均为阴性。紫外线照射法其优点在于：完好保持了分枝杆菌的抗酸染色特性，而且它不仅杀灭痰膜上的分枝杆菌，也杀灭了制片过程中产生的气溶胶中的分枝杆菌；该法无需特殊的仪器设备，也不需要配制试剂，安全、简便。但是由于紫外线的穿透能力较弱，且其杀菌效果与其辐照强度、照射时间及照射距离密切相关，并受环境相对湿度影响[3]，所以利用生物安全柜中紫外灯照射消毒涂片，涂片应均匀涂抹、厚度适宜，不宜过厚，辐照剂量要至少达到1195200μw·s/cm2。使用中的紫外线灯管应定期擦拭清洁，并对其辐照强度进行监测，及时更换灯管，以达到有效消毒目的。

本实验证明有效氯含量为50 g/L的次氯酸钠溶液，处理痰液10～15 min，可有效杀灭痰液中的分枝杆菌。次氯酸钠溶液沉淀法与离心法其抗酸染色镜检结果差异无统计学意义（P＞0.05），与Rasheed等[4]报道相同。但与对照组相比，次氯酸钠溶液消毒组镜检结果分级降低，并出现高假阴性，与相关文献[5-6]报道一致。次氯酸钠溶液消毒法其优点在于：方法简便，试剂便宜，且易取得；由于次氯酸钠消化了痰液中的黏液及细胞，使得显微镜下视野背景单一，更加清晰，提高了阅片的速度；相关文献[6]报道次氯酸钠消毒法敏感性较直接涂片法提高。缺点在于：次氯酸钠溶液不稳定，在使用过程中要注意低温、避光保存；处理痰液的时间要把握准确，据报道称次氯酸钠接触时间过长，会对分枝杆菌造成损伤，当时间＞60 min时，则可能导致抗酸杆菌的检出率逐渐降低[5]；次氯酸钠溶液消毒法特异性较传统直接涂片法有所降低[6]。

高压蒸汽灭菌法其涂片镜检，镜下背景干净、清晰，经离心其镜检结果分级高于对照组（P＜0.05）。相关文献[7]亦报道高压灭菌后离心痰液，所制成的痰涂片，抗酸杆菌检出率有效提高。但是本研究发现，痰液经高压灭菌后，由于痰液中的蛋白质变性，痰膜较脆弱，在染色过程中易脱落，实验中有1份样本由于涂片痰膜彻底脱落，而致无法进行随后的镜检工作。高压灭菌法优点在于集菌效果显著，且消毒彻底，杀灭了一切微生物，大大提高了实验室生物安全。但是对盛装痰液的容器有要求，必须为耐高温、高压材料；而且实验室必须配备高压蒸汽灭菌锅及适合的离心机；染色时需谨防痰膜脱落。由于处理痰液标本需要3 h左右，故此法仅适用于批量处理样本。

[1] Joshi R, Reingold AL, Menzies D, et al. Tuberculosis among health-care workers in low- and middle-income countries: a systematic review[J]. PLoS Med, 2006, 3(12): e494.

[2] 中国防痨协会基础专业委员会. 结核病诊断实验室检验规程[M]. 北京: 中国教育文化出版社, 2006: 13-37.

[3] 杨华明, 易滨. 现代医院消毒学[M]. 北京: 人民军医出版社,2002: 55-60.

[4] Rasheed MU, Dechu T. An overnight sedimentation method:improving the diagnosis of tuberculosis when electrical centrifuge is not available[J]. Trop Doct, 2008, 38(2): 78-79.

[5] Bonnet M, Ramsay A, Githui W, et al. Bleach sedimentation:an opportunity to optimize smear microscopy for tuberculosis diagnosis in settings of high prevalence of HIV[J]. Clin Infect Dis, 2008, 46(11): 1710-1716.

[6] Cattamanchi A, Davis JL, Pai M, et al. Does bleach-processing increase the accuracy of sputum smear microscopy for diagnosing pulmonary tuberculosis?[J]. J Clin Microbiol,2010, 48(7): 2433-2439.

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