云南3个盐矿真菌活性菌株的筛选

李治滢，杨丽源，李绍兰，董明华，周新丽，肖 炜，董亚仲，杨有清，杨云溢

(1.云南大学省微生物研究所，云南昆明 650091;2.南盐化股份有限公司乔后盐矿，云南大理 651207;3.云南盐化股份有限公司一平浪盐矿，云南楚雄 651214;4.云南盐化股份有限公司昆明盐矿，云南昆明 650300)

盐矿环境属于极端环境，生存在极端环境中的微生物，具有极为特殊的生理结构和代谢机制，同时还产生了许多具有特殊性质的生物活性物质。所以对盐矿真菌的活性研究既具有理论意义，又有应用价值。目前对云南盐矿微生物的研究主要集中在对放线菌、细菌和古菌的资源及新种研究［1-4］，对真菌的研究只局限在本课题组对一平浪盐矿的耐盐真菌种群调查。本研究对云南乔后盐矿、一平浪盐矿和昆明盐矿的真菌进行抗菌活性和产胞外酶活性的筛选及活性真菌菌株的鉴定，为今后开发云南盐矿真菌的应用奠定理论基础及菌种资源的储备。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 实验样品于2009年11月采自云南省乔后盐矿、一平浪盐矿和昆明盐矿。样品有盐卤、盐卤水源、岩盐矿、盐卤池底泥及盐卤池周围土壤。

1.1.2 供试指示菌 环境病原细菌:枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis);人体致病细菌:大肠埃希菌(Escherichia coli)，藤黄八叠球菌(Sarcina lutea)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，表皮葡萄球菌(Staphylococcus aureus);人体致病真菌:白假丝酵母(Candida albicans)，石膏样小孢子菌(Microsporum gypseum)，星形石膏样毛癣菌(Trichophyton gypseum asteroides);植物病原真菌:木霉(Trichodermasp.)，小克银汉霉(Cunninghamellasp.)，毛壳菌(Chaetomiumsp.)，灰葡萄孢(Botrytis cinerea)，根串珠霉(Thieliviopsissp.)。以上供试菌株均为云南省微生物研究所保存。

1.1.3 培养基 培养基(g/L):①盐矿真菌分离培养基:PDA培养基(马铃薯200，葡萄糖20，琼脂15)，临用时加青霉素(80 U/mL);马丁氏培养基(葡萄糖10，蛋白胨5，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.5，孟加拉红0.033，琼脂1.8)，倒皿时加青霉素(80 U/mL);YM培养基(酵母膏3，蛋白胨5，麦芽汁3，葡萄糖10，琼脂20)，临用时加1 mol/L的盐酸溶液(0.7 mL/100 mL)。以上培养基中分别按5%、10%、15%、20%(质量体积比)加入氯化钠;②抗菌活性筛选培养基:PDA培养基，PDB培养基，营养肉汤培养基(蛋白胨5，牛肉膏3，氯化钠5，琼脂15，pH 7.0)和沙博弱氏(Sabouraud)琼脂培养基(葡萄糖4，蛋白胨10，琼脂18，pH 5.6);③胞外酶活性筛选培养基:蛋白酶培养基［5］，淀粉酶培养基［6］，纤维素酶培养基［7］，脂肪酶培养基［8］;④鉴定培养基:PDA培养基，诱发真菌孢子的培养基(KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.5，KNO31，KCl 0.5，蔗糖0.2，葡萄糖0.2，琼脂20)。在1×105Pa灭菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 盐矿真菌的分离 岩盐矿、底泥及土壤样品采用梯度稀释涂皿法，盐卤及水源样品采用过滤收集菌体或原样品直接涂皿法进行真菌分离。置于室温避光培养5～45 d。

1.2.2 盐矿真菌发酵液的制备 ①将分离所得的真菌菌株分别接入PDB培养基中，于(28±2)℃，160 r/min的摇床上振荡培养6 d，过滤去除菌体，发酵液作为产胞外酶活性筛选备用;②同样制备发酵液，在发酵液中加等体积的95%乙醇浸提48 h以上，过滤弃菌丝体浓缩浸提液，制成菌株的发酵浸提样品以备用作抗菌活性筛选。

1.2.3 指示菌的培养 将指示菌接入营养肉汤液体培养基、沙博弱(Sabouraud)氏斜面或PDA培养基斜面，置于(37±1)℃或(28±1)℃培养箱中培养待用。

1.2.4 盐矿真菌抗菌活性的初筛和复筛 选取14株指示菌进行抗菌活性筛选，对盐矿真菌的发酵乙醇浸提浓缩液进行抗菌实验。抗菌实验采用滤纸片法进行，方法参照文献［9］。

1.2.5 产胞外酶活性真菌的筛选 选取产蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶及脂肪酶4种培养基，采用纸片平板筛选方法对所分离获得的真菌进行产胞外酶活性的定性筛选:在无菌条件下用滤纸片蘸取盐矿真菌发酵液，分别轻轻平放在相应的孢外酶定性筛选培养基上，置于(28±1)℃培养箱中培养2～4 d，观察其透明圈及晕圈。

1.2.6 活性菌株的鉴定 采用插片培养方法，对筛选到的活性菌株通过显微形态特征的观察进行鉴定，鉴定检索参照文献［10-11］。

1.2.7 活性菌株的耐盐(NaCl)实验 挑选具有表现较好功能酶活性或抗菌活性的真菌菌株34株进行耐盐(NaCl)实验。基础培养基为PDB，采用振荡培养((28±2)℃，160 r/min)，每3 d观察其生长情况，直到15 d。NaCl浓度(质量体积比)分别为:0%、3%、5%、8%、10%、12%、15%、18%、20%、25%、30%和35%共12个浓度。

2 结果与分析

2.1 3个盐矿真菌的分离结果

通过在分离平板上菌落的挑取、纯化和并菌，从云南3个盐矿中共获得真菌523株。乔后盐矿279株，昆明盐矿138株，一平浪盐矿106株。

2.2 抗菌活性筛选结果

2.2.1 活性菌株的初步鉴定 经过抗菌活性的初筛和复筛，获得51株有抗菌活性的菌株，初步鉴定为3个目、1个类群、4个科、19个属(见表1)。

表1 云南3个盐矿抗菌活性菌株数量及分布Table1 The distribution and number of antifungal strains of fungi isolated from three salt mines in Yunnan

2.2.2 活性菌株的分布 51株有抗菌活性的菌株占分离总菌株数的9.75%;乔后盐矿、昆明盐矿和一平浪盐矿各有29株、13株和9株(见表1)。在抗菌活性菌株中，青霉(Penicillium)和曲霉(Aspergillus)是3个盐矿共有的属，其中青霉有23株为优势属，占活性菌株的45.10%;曲霉(Aspergillus)有7株，占活性菌株数的13.73%;乔后盐矿的活性菌株种群分布最丰富，有14属，侧孢(Choloridium)、汉斯霉(Hansfordia)、壳小圆孢(Coniothyrium)、绿僵菌(Metarrhizium)、毛茎点霉(Chaetophoma)、稀丝头孢霉(Haplotrichum)、芽枝霉(Cladosporium)、粘帚霉(Gliocladium)、束丝菌(Ozonium)、丝核菌(Rhizoctonia)、组丝核菌(Phacodium)、丝葚霉(Papulospora)只在乔后盐矿有分布;昆明盐矿的活性菌株有5个属，阜孢霉(Papularia)、交链孢(Alternaria)和盘单毛孢霉(Monochaetia)仅在昆明盐矿有分布;一平浪盐矿的活性菌株有4个属，木霉(Trichoderma)和盘多毛孢霉(Pestalo-tia)只出现在一平浪盐矿。

2.2.3 活性菌株的抗菌活性 在筛选得到的抗菌活性菌株中，对白假丝酵母(Candida albicans)有抗菌活性的菌株最多，共有26株，占抗菌活性菌株数的50.98%，并且分布的菌株种群多，涉及16个属;其次是拮抗木霉和灰葡萄孢(Botrytis cinerea)菌株，分别有23株和20株;对大肠埃希菌(Escherichia coli)和根串珠霉(Thieliviopsis)有抗菌活性的菌株较少，分别仅为5株和3株;未筛选到对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)有抗菌活性的菌株(见表2)。本次研究共有10株盐矿真菌对本次实验中的5株及5株以上的指示菌有拮抗作用。

2.3 产胞外酶活性定性筛选结果

2.3.1 产酶菌株的初步鉴定 采用纸片平板筛选法对所分离获得的3个盐矿真菌进行产胞外酶活性的定性初筛和复筛，结果有67株具有产胞外酶的活性，初步鉴定为3个目、1个类群、5个科、26个属(见表3)。

表2 云南3个盐矿真菌抗菌活性及其分布Table2 Antipathoginic activities strains and distribution of fungi isolated from three salt mines in Yunnan

续表

表3 云南3个盐矿产胞外酶真菌菌株及分布Table3 Production of extracellular enzymes strains and distribution of fungi isolated from three salt mines in Yunnan

2.3.2 产酶菌株的分布 67株产胞外酶活性菌株占总菌株数的12.81%;乔后盐矿、一平浪盐矿和昆明盐矿各筛选到35株、21株和11株(见表3)。在3个盐矿的产胞外酶活性菌株中，青霉属均是它们的优势属种，分别占乔后盐矿、一平浪盐矿和昆明盐矿活性菌株中的34.29%、42.86%和63.64%;在产酶活性菌株的种群分布中，乔后盐矿分布的较广，有17个属，其次是一平浪盐矿11个属，昆明盐矿只分布有5个属;在活性菌株的分布中，青霉属和曲霉属在3个盐矿中均有分布，芽枝霉属、束丝菌属和丝核菌属只分布在乔后盐矿和一平浪盐矿。

2.3.3 产酶菌株的产酶活性 在4种胞外酶的定性筛选结果中，产胞外纤维素酶的有58株，产蛋白酶和淀粉酶的菌株各有41株和26株(见表4)，各占3个盐矿产酶活性菌株86.57%、61.19%和38.81%;产纤维素酶的菌株种群最多，有25个属，产蛋白酶和淀粉酶的各有13个属和11个属;获得9株能同时产胞外纤维素酶、蛋白酶和淀粉酶的盐矿真菌:青霉和曲霉各3株，壳小圆孢、盘多毛孢霉和交链孢各1株。本次研究未筛选到产胞外脂肪酶的菌株。

表4 云南3个盐矿真菌的产胞外酶筛选结果Table4 The results of production of extracellular enzymes of fungi isolated from three salt mines in Yunnan

续表

2.4 活性菌株的耐盐实验结果

从3个盐矿的抗菌活性或产酶活性的筛选结果中挑选了34株活性较好的真菌菌株进行耐盐(NaCl)实验。结果都有不同程度的耐NaCl特性(见表5)，其中有7株的耐盐浓度达到35%，最低的为10%。34株真菌菌株其耐盐浓度的差异较大。耐NaCl浓度为35%的主要为青霉属，还有曲霉属和交链孢属。

表5 云南3个盐矿真菌活性菌株的耐盐实验结果Table5 The results of salt-tolarant experiment of fungi isolated from three salt mines in Yunnan

3 讨论

从云南3个盐矿筛选到的抗菌活性菌株，对白假丝酵母有拮抗作用的最多，其中有3株为高抗菌株(抑菌圈直径≥15 mm)，分别为青霉、曲霉和阜孢霉。抗菌活性菌株中有2株具有广谱抗菌作用，能对本次实验中的8株指示菌有不同程度的拮抗作用，分别为绿僵菌属和曲霉属。

具有抗菌和产胞外酶活性能力的盐矿真菌有16株:青霉8株，曲霉2株，稀丝头孢霉、侧孢、毛茎点霉、盘多毛孢霉、芽枝霉和壳小圆孢各1株。在这16株菌株中有2株的耐盐浓度均可达35%，产蛋白酶和纤维素酶的活性较强;有2株为30%，它们分别属于青霉和曲霉。高盐环境能够激活真菌的一些沉默基因，产生低盐环境所不产生的代谢产物。所以本实验中筛选到高盐环境中具有抗菌活性和产胞外酶能力的真菌菌株，为今后寻找新型的抗生素药物开辟新资源，同时也为工业治污、排污提供新的微生物资源。

致谢感谢云南盐化股份有限公司在工作上的鼎力相助，在此表示诚挚谢意!

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