不同北虫草菌种的收集与分离

修翠娟，王艳华，孟 双，陈 杰，吴英春

(1.辽宁省微生物科学研究院，辽宁朝阳 122000;2.辽宁省科技创新体系建设服务中心，辽宁沈阳 110004)

北虫草是一种名贵药用真菌，(Cordyceps militaris(L.)Link)又称蛹虫草，北冬虫夏草，是一种兼具食用和药用价值的大型真菌。隶属子囊菌门、肉座菌目、麦角菌科、虫草属，是虫草属的模式种，为虫生药用真菌。近年的研究表明，北虫草除了富含蛋白质、氨基酸、维生素及钙、锰、锌、硒等微量元素外，还含有虫草素、虫草酸、过氧化物歧化酶(SOD)等生物活性物质，具有增强动物机体免疫力、抗肿瘤、抗辐射、降血糖、降血脂、抗疲劳、延缓衰老等多种生理功效［1-2］。因滋补、药用功效与天然冬虫夏草相近，选为冬虫夏草的最佳替代品而进行大量的人工培育，近些年来栽培范围呈逐渐扩大趋势［3］。北虫草菌丝变异很快，种性退化要比一般的菌类快的多，优良菌种的选育是提高北虫草子实体生物转化率和产品质量的前提条件和关键。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 北虫草鲜体的收集 前后共收集到北虫草鲜体8个品株，具体生长特征见表1、图1。

1.1.2 培养基 培养基配方:马铃薯200 g，葡萄糖20 g，磷酸氢二钾0.1 g，硫酸镁0.1 g，琼脂20 g，水1 000 mL。

1.2 方法

北虫草的菌株分离包括组织分离和孢子分离2种。由于孢子分离菌株得到的较多，后期菌株进行比较的工作量较大，并且一些文献表明，孢子分离得到的北虫草菌株性状不稳定，而且生物转化率较组织分离低，子座组织分离得到的北虫草菌株，一般菌丝发育健壮、活力强，生物转化率也较高［4］，本实验采用组织分离法。

表1 不同品种的北虫草生长特征对比Table1 Characteristics of Different Cordyceps militaris

图1 不同品种的北虫草生长特征对比Fig.1 Characteristics of Different Cordyceps militaris

1.2.1 菌种组织分离 ①消毒:取新鲜、颜色鲜艳、生长正常、形态健壮、颜色橙黄或橘红色北虫草子座，先用清水冲洗，再置于75%的酒精或0.1%升汞中浸泡消毒2～3 min，取出子座以无菌水反复冲洗子座2～3次，放在无菌器皿内备用;②组织分离培养:用无菌剪刀将消毒的蛹虫草子座剪成长度1～2 mm的小段，接种于PDA试管或平板固体培养基上，放置在22～25℃的恒温培养箱中培养。培养48～72 h，菌丝开始萌发，在组织块周围长出放射状的菌丝。北虫草菌丝白色，粗壮浓密，呈匍匐状紧贴培养基生长。及时选择无污染的菌丝体，接种于新的培养基上进一步分离，最终得到纯化的北虫草菌株。第一代菌株为母种，为F0级，依次传代为F1级，F2级，F3级。

1.2.2 出草实验 为验证分离菌种是否为所需菌种，把分离得到的菌种回接到米饭或小麦培养基上进行出草试验，接种后生长速度快，不污染，生长周期短，从子座形成到成熟不超过50～60 d，出草整齐，草型好，生物转化率高的菌种可作为优良的生产菌种。在蛹虫草的栽培过程中，不出草的原因大多是因为菌种质量有问题。所以优质的菌种是出草的前提，精细的管理是高产优质的保证。

2 结果与分析

菌株的鉴定:组织分离得到的北虫草菌株需要进行菌株鉴定，以确定得到的菌株是否是北虫草菌株。菌株鉴定包括直接观察法、镜检法、出草实验。

2.1 北虫草菌体在PDA固体培养基上的生长情况观察

直观法就是靠人的肉眼进行直接观察菌落形态，蛹虫草菌丝体初期为白色，粗壮，呈绒毛状，略有爬壁。受光线刺激与基质结合处呈现黄色。随着时间的延长，由黄色逐渐变成橘黄色。观察不同的蛹虫草菌体在PDA培养基上的生长情况，结果见表2、图2。

表2 不同北虫草菌丝体在PDA培养基5 d生长情况Table2 Growth of different cordyceps militaris on PDA Culture after 5 day

图2 不同北虫草菌丝体在PDA培养基5 d生长情况Fig.2 Growth of different cordyceps militaris on PDA Culture after 5 day

一般来说，蛹虫草菌丝体在第2～3天可观察到，第4、5天左右生长较好，菌落生长旺盛。优质的蛹虫草菌株在培养初期菌丝为白色，粗壮浓密，边缘整齐，匍匐状紧贴培养基生长，培养后期或者见光后，分泌黄色色素，菌落呈浅黄色到橘黄色。蛹虫草菌丝变异很快，种性退化要比一般的菌类快的多，如果只是单纯的分离留菌种，就有可能大面积的减产。所以对北虫草菌种生长特性的观察与研究非常重要。

2.2 出草实验

除了对北虫草的菌落及显微形态观察外，还应该进行出草实验，出草实验是最直接的鉴定方法，对于分离得到的菌株，在用于生产之前都必须做出草实验，以了解其出草情况、质量、生长周期和生物学效率。在出草实验期间，主要观察各个菌株萌发的时间、见光转色的能力以及是否形成大量的气生菌丝，以及出草时间是否正常，出草是否整齐等。有的蛹虫草菌株在营养生长阶段受到微弱的光刺激就可以转色，并进入原基分化阶段;而有的蛹虫草菌株即使长满培养基并给予充分的光刺激也不发生转色效应，这样的菌株一般难以出草，必须及时淘汰。有的虽然出草，但很慢使得生产周期延长，或者虽然出草但长短不一，较稀疏，或者菌株变异草体异常变粗或变细，这样的菌株都不能做为生产菌株。

3 讨论

高产菌株的筛选直接关系到北虫草人工栽培的商业回报，优良的北虫草子实体是获得优良人工栽培菌株的首要保证［6］。用于组织分离的虫草子座必须新鲜、生长正常、形态健壮、颜色橙黄或橘红色。子座分离的不同部位对子实体生长的影响都非常大。

在进行规模生产前，必须从获得的北虫草菌株中选取性状优良的进行出草实验，出草实验成功后才可进行真正的规模生产。

北虫草高产菌株的筛选有许多关键因素，筛选出优良菌株后，菌株的保藏条件、保藏时间，传代复壮次数都对北虫草的生长有至关重要的影响［7］。优良的菌株传2～3代后活力性状下降，不能保证正常出草，必须再挑选优良的北虫草子座再次进行组织分离，重新筛选优良高产栽培菌株，优良菌株的收集与筛选是北虫草生产的重要基础。

［1］李亚洁，王鹤，孟楠，等.蛹虫草菌种复壮技术的研究［J］.食用菌，2006，28(2):18-19.

［2］郑剑玲，齐贺，黄竹青，等.北虫草菌丝发酵液和子实体抗氧化活性测定［J］.微生物学杂志，2012，32(6):93-95.

［3］都兴范，李亚杰，王林华，等.北冬虫夏草的研究发展现状［J］.辽宁农业科学，2003，(4):26-28.

［4］江西强，张韧.北冬虫夏草的形态特征及人工瓶栽技术［J］.江苏农业科学报，2002，6:84-85.

［5］康信聪，刘东波，夏志兰，等.北冬虫夏草DNA提取方法的比较［J］.湖南农业大学学报(自然科学版)，2011，37(2):147-149.

［6］孙叶，陈秀兰，严巧玲，等.蛹虫草规模化人工栽培技术要点［J］.江苏农业科学，2008，(6):145-146.

［7］姜明兰，钟文田.北冬虫夏草人工栽培技术研究［J］.辽宁农业科学，1995，(1):54.