猴头菇不同活性部位体外抗氧化活性研究

吴美媛，王喜周，周英，王超，许维丹

（丽水学院成教学院，浙江丽水 323000）

猴头菇（Hericium erinaceus），又名猴头蘑、熊头菇、刺猬菇，录属于担子菌门，猴头菌科，是著名的药食两用菌。猴头菇性平，味甘，能利五脏，助消化，具健胃，益精，补虚，抗癌之功效。现代研究表明猴头菇可增强机体免疫力、抗溃疡、抗肿瘤及延缓衰老等多种作用[1-2]。

自由基是生物体氧化过程中产生的中间代谢产物，与机体衰老有密切关系，机体不断产生和清除自由基，以保持动态平衡。如果机体产生自由基的能力超出了清除能力，自由基就会直接或间接地引起蛋白质变性、多糖降解、DNA 断裂，造成细胞损伤或死亡[3]，补充清除机体自由基的营养物质，对维护人体健康，延缓衰老有很大的意义[4]。本课题以抗氧化活性为指标，筛选了猴头菇的提取溶剂，制备出具有优良抗氧化活性的提取物，同时为猴头菇功能食品的开发提供了参考。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

BS124S 电子天平（Sartorius）；LZ-26 薄膜蒸发浓缩器（厦门化工医药机械厂）；DL-6000B 离心机（湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司）；Shimadzu2450 紫外可见分管光度计（日本岛津公司）。

1.2 试剂

猴头菇细粉：100 目，浙江方格药业有限公司；ABTS试剂：singma；DPPH 试剂：singma；丙酮、乙醇、水杨酸、硫酸亚铁、双氧水、磷酸一氢钠、磷酸二氢钠：均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

2 方法

2.1 样品溶液制备

分别用水、50%乙醇和丙酮提取猴头菇。水提取物：称取猴头菇细粉20 g，置于500 mL 圆底烧瓶中，加30 倍蒸馏水，100°C 浸提3 h，过滤，滤液减压浓缩，即得水提取物；醇提取物：称取猴头菇细粉20 g，置于500 mL 圆底烧瓶中，加15 倍50 %乙醇，75 °C 浸提1.5 h，过滤，滤液减压浓缩，即得醇提取物；丙酮提取物：称取猴头菇细粉20 g，置于500 mL 圆底烧瓶中，加15 倍丙酮，55°C 浸提1.5 h，过滤，滤液减压浓缩，即得丙酮提取物。

称取水提取物、乙醇提取物、丙酮提取物各2.0 g，分别用相应的溶剂将其配置成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mg/mL 的样品溶液，备用。

2.2 体外抗氧化活性测定

分别测定猴头菇水提物、乙醇提取物及丙酮提取物对·OH 自由基、DPPH·自由基及ABTS+自由基的清除能力，数据采用SPSS16.0 处理，组间比较采用方差分析和t 检验。

2.2.1 ·OH 自由基清除能力测定

分别取不同浓度样品2 mL 于试管中，依次加入6 mmol/LFeSO4，6 mmol/LH2O2各2mL，摇匀，静置10min，再加6mmoL/L 水杨酸2mL，摇匀，静置30min，于510nm处测定Ai，以蒸馏水代替6 mmoL/L 水杨酸，测得Aj，以蒸馏水代替样品测定A0，重复3 次，按下式计算·OH自由基抑制率[5]。

式中：Ai、Aj、A0分别代表样品组、样品空白组及对照组的吸光度。

2.2.2 DPPH·自由基清除能力测定

分别取不同浓度样品2 mL 于试管中，加入2 mL 2×10-4moL/L 的DPPH 的无水乙醇溶液，混合均匀，暗处反应30 min 后于517 nm 处测定Ai，以无水乙醇代替2×10-4moL/L DPPH 测得Aj，以蒸馏水代替样品溶液测得A0，重复3 次，按下式计算DPPH·自由基清除百分率。

式中：Ai、Aj、A0分别代表样品组、样品空白组及对照组的吸光度。

2.2.3 ABTS+自由基清除能力测定

取ABTS 10 mg，K2S2O82.9 mg 溶于10 mL 0.01 moL/L磷酸钠缓冲液中，25 ℃避光储存16 h～18 h，备用。实验当日取ABTS 液2 mL 加18 mL 0.01 moL/L 磷酸钠缓冲液，调节吸光度在734 nm 处为0.7。分别取0.2 mL不同浓度样品于试管中加3.8 mL 上述ABTS 分析液，6 min 后734 nm 测得Ai，以蒸馏水代替ABTS 分析液测得Aj，以蒸馏水代替样品溶液测得A0，重复3 次，按下式计算ABTS+自由基清除百分率。

式中：Ai、Aj、A0分别代表样品组、样品空白组及对照组的吸光度。

3 结果与讨论

3.1 提取物得率

热水、乙醇和丙酮提取物得率分别为：（4.15±0.49）%、（7.35±0.58）%和（5.33±0.61）%。

3.2 体外抗氧化活性测定

3.2.1 对·OH 自由基的清除作用

H2O2与Fe2+混合产生·OH，在反应体系中加入水杨酸，能有效捕捉·OH，从而生成2，3-二羟基苯甲酸，该产物在510 nm 处有强吸收，若有抗氧化物质加入，便会与水杨酸竞争，从而使有色产物的生成量减少。因此在510 nm 处比色，可以评价受试物清除·OH 的能力。猴头菇不同溶剂提取物对·OH 自由基的清除作用见图1。

图1 ·OH 自由基的清除作用Fig.1 ·OH radical scavenging capacity of VCand the different solvents extraction

由图1 可见3 种溶剂提取物对·OH 自由基都有一定的清除作用，并表现出一定的量效关系，各浓度下，乙醇提取物对·OH 自由基的清除作用均显著高于热水及丙酮提取物（P＜0.01），在2.0 mg/mL 时，热水、乙醇及丙酮提取物对·OH 自由基的清除率分别为（51.53±1.83）%、（65.64±1.97）%和（37.28±2.12）%。

3.2.2 对DPPH·自由基的清除作用

DPPH 是一种稳定的自由基，在有机溶剂中呈紫色，在517 nm 波长处有较大吸收，当加入抗氧化剂时，一部分自由基被清除掉，使该波长下吸收强度减弱，可借此来评价某物质的抗氧化活性。猴头菇不同溶剂提取物对DPPH·自由基的清除作用见图2。

结果可知3 种溶剂提取物对DPPH·自由基都有一定的清除作用，且随着浓度的增大清除能力增强。乙醇提取物和丙酮提取物对DPPH·自由基的清除作用无显著性差异（P＞0.05），在0.2 mg/mL～1.0 mg/mL 浓度范围内，热水提取物对DPPH·自由基清除作用显著优于乙醇及丙酮提取物（P＜0.01），在2.0 mg/mL 时热水、乙醇及丙酮提取物对DPPH·自由基的清除力无差异（P＞0.05），清除率分别为（60.2 ±2.07）%，（62.15±2.23）%和（59.16±1.74）%。

图2 DPPH·自由基的清除作用Fig.2 DPPH·radical scavenging capacity of VCand the different solvents extraction

3.2.3 对ABTS+自由基的清除作用

ABTS 作为一种间接检测方法，使用范围最广泛，ABTS 经氧化后生成稳定的蓝绿色阳离子自由基ABTS+，能溶于水相或酸性乙醇介质中，在734 nm 处有最大吸收，可用于亲水性和亲脂性物质抗氧化能力测定。被测物质加入ABTS+溶液后，所含抗氧化成分能与ABTS+发生反应而使反应体系褪色。在ABTS+的最大吸收波长734 nm 处检测吸光度的变化，可用于测定样品对ABTS+自由基的清除能力。猴头菇不同溶剂提取物对ABTS+自由基的清除作用见图3。

图3 ABTS+自由基的清除作用Fig.3 ABTS+radical scavenging capacity of VCand the different solvents extraction

结果可知3 种溶剂提取物对ABTS+自由基都有一定的清除作用，且随着浓度的增大清除能力增强。在各浓度下乙醇提取物显对ABTS+自由基清除作用著优于丙酮提取物（P＜0.01），在0.2 mg/mL～1.0 mg/mL 浓度范围内，乙醇提取物与热水提取物无显著性差异（P＞0.05），当浓度为2.0 mg/mL 时，乙醇提取物对ABTS+自由基的清除能力显著优于热水提取物（P＜0.01）。热水、乙醇及丙酮提取物对ABTS+自由基的清除率分别为（52.06±2.31）%、（63.84±1.72）%，（49.59±2.16）%，结果表明乙醇提取物对ABTS+自由基清除作用最好。

4 结论

本研究比较猴头菇的热水、乙醇及丙酮提取物的体外抗氧化能力，以·OH 自由基、DPPH·自由基和ABTS+自由基的清除率为指标，筛选合适的提取溶剂，制备出具有较好抗氧化活性的提取物。研究结果表明以乙醇作为提取溶剂，制备提取物对·OH 自由基、DPPH·自由基及ABTS+自由基均表现出良好的清除能力，仅在0.2 mg/mL～1.0 mg/mL 的较低浓度下，水提物对DPPH·自由基的清除优于乙醇提取物，但是在较高浓度2 mg/mL 浓度下，醇提物对DPPH·自由基的清除率略高于水提物。

以体外药理活性为导向，比较猴头菇不同的提取溶剂的抗氧化效果，结果发现乙醇为最佳溶剂，本研究为猴头菇保健品开发提供思路和参考。

[1]Su X Y,Wang Z Y,Liu J R.In vitro and in vivo antioxidant activity of Pinuskoraiensis seed extract containing phenolic compounds[J].Food chemistry,2009,117(4)：681-686

[2]杜志强,杨晨晨,王建英.猴头菇多糖对小鼠血清抗氧化能力的影响[J].食品研究与开发,2011,32(9)：57-59

[3]Knight J A.Diseases related to oxygen-derived free radicals[J].Annals of clinical and laboratory seience,1995,25(2)：111-121

[4]Yun Z F,Sheng Y,Guoyao W.Free radicals,antioxidants,and nutrition[J].Nutrition,2002,18(10)：872-879

[5]方玉梅,张春生,谭萍,等.金针菇黄酮类化合物的抗氧化性作用[J].食品研究与开发,2012,33(3)：15-18