油茶籽油抗氧化及对自由基清除作用研究

2013-07-22徐俐耿阳阳张红梅

食品研究与开发 2013年17期

徐俐，耿阳阳，张红梅

（贵州大学生命科学学院，贵州省农畜产品贮藏与加工重点实验室，贵州贵阳 550025）

油茶籽油（Camellia Oleifera Oil）是从山茶科山茶属灌木植物油茶（Camellia ofeifera Abel）的种子中提取出来的油脂。因其脂肪酸组成与世界著名的优质食用橄榄油十分相似，故素有“东方橄榄油”之称。油茶籽油，色佳味香，营养丰富，具有重要的医药价值[1]，经深加工后可制成高级护肤化妆品、精油和皂素等系列产品。大力发展油茶籽油，对促进我国经济发展具有重要意义[2]。

茶多酚是一种性能十分优异的天然抗氧剂，因其抗氧化性高于合成抗氧化剂，天然无毒副作用等特点，近年来成为各工业化国家的技术竞争和研究开发的目标[3]。茶多酚应用在油脂中能有效延长贮藏期[4]。黄佳聪等研究了腾冲红花油茶籽油中多酚类物质具有较强的清除自由基的作用[5]，茶油中多酚类物质较高，具有较强的稳定性，是否配合茶多酚使用，即增强对氧化稳定性，又对自由基的清除作用协同作用，少见报道。因此，研究茶多酚在油茶籽油应用，将大大拓展油茶籽油的应用市场，解决油茶籽油期贮藏存在的氧化问题，并对人们的健康、拉动我国粮油市场经济起到积极作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料册享油茶籽油，2012 年2 月购于贵州省册亨县市场；98%茶多酚，无锡世纪生物科技公司生产；99.83%特丁基对苯二酚（TBHQ）：东莞市广益食品添加剂实业有限公司。

1.1.2 主要试剂

2，2-二苯基-1-苦肼基自由基（DPPH）标准品，Singma 公司；三吡啶三吖嗪（TPTZ）、水杨酸、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、盐酸、双氧水、硫酸亚铁、乙醇、冰乙酸、溴水、异辛烷、碘化钾、硫代硫酸钠、氢氧化钾、乙醚、没食子酸、钨酸钠、钼酸钠、碳酸钠、磷酸、硫酸锂等均为分析纯。

FC 显色剂[5]：将10 g 钨酸钠、2.5 g 钼酸钠、350 mL蒸馏水、5 mL85%磷酸及10 mL 浓盐酸加入带回流装置的500 mL 圆底烧瓶中，充分混合，微沸回流2 h 再加入15 g 硫酸锂，5 mL 蒸馏水及数滴溴水，开口沸腾20 min（至溴水挥发为止），冷却定容至100 mL，过滤，置棕色瓶中，冷藏保存备用。使用时加入1 倍蒸馏水稀释。

FRAP 工作液[5]：用40 mmol/L 盐酸溶液溶解，配成1.6 mmol/L TPTZ 溶液，配制pH3.6、300 mmol/L 的醋酸盐缓冲液和20 mmol/LFeCl3溶液。三者按1 ∶100 ∶1 的比例混合，即可配成FRAP 工作液。

1.1.3 仪器与设备

AE100S 型电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；SRZ-JJI 循环水式多用真空泵：上海雅荣生化设备仪器有限公司；RE-5298 旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；SK-1 快速混匀器：武汉格莱莫检测设备有限公司；XMTD-204 数显恒温水浴锅：上海梅香仪器有限公司；DHG-9240A 电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；TU-1810PC 紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 制备添加抗氧化剂的油茶籽油

分别称取质量浓度为98%的茶多酚，溶于少量无水乙醇中，加入1.8 g 的磷脂，混匀后加入450 g 油茶籽油，搅拌均匀，得质量浓度为0.02%、0.03%、0.04%的茶多酚（TP）处理油；再称取TBHQ 溶于450 g 茶油中，得到质量浓度为0.02%TBHQ 的茶油；与不添加的油茶籽油（CK）为对照，分别混匀后，装入玻璃瓶中，一起放置在（62±2）℃恒温箱中进行抗化氧化实验，每24 h 测定油茶籽油的过氧化值（POV）和酸值，并转换各组在烘箱中的位置，贮藏前后提取极性酚类，测定对总抗氧化活性及对DPPH 清除率、羟基阴离子和超氧阴离子的抑制率。

1.2.2 油茶籽油的过氧化值测定

参照GB/T5538—2005[6]。

1.2.3 油茶籽油的酸值的测定

参照GB/T5530—2005[7]。

1.2.4 多酚类物质的提取

参阅Folin—Ciocalteau[8]。

贮藏前后分别称取油茶籽油各（100±0.50）g，分别用80%乙醇按油醇体积比1 ∶3 加入乙醇，置于50 ℃恒温水浴锅中萃取30 min，3 000 r/min 下离心5 min 收集上层离心液，重复3 次合并离心液，经真空浓缩，称重得待测样品液，避光保存备用。

1.2.5 油茶籽油多酚类物质总酚含量的测定

1.2.5.1 制作没食子酸的标准曲线

参照Folin-Ciocalteui 法[9-10]。

1.2.5.2 茶籽油中多酚类物质总酚含量的测定

分别吸取50 μL 待测样品液到10 mL 带刻度试管中，用蒸馏水补足到6 mL，再顺序加入1 mLFC 显色剂溶液，3 mL7.5%Na2CO3溶液，在快速混匀器上迅速摇匀，室温放置显色2 h，在765 nm 波长下测定吸光值。由标准曲线求得对应的酚类物质的质量浓度，以没食子酸计。

1.2.6 FRAP 法测定多酚类物质的总抗氧化活性

1.2.6.1 FeSO4的标准曲线

取不同体积（0～400 μL）的1 mmol/L FeSO4溶液，用蒸馏水补足到2 mL，再加入配制好的FRAP 工作液3 mL，混匀后于37 ℃反应30 min，在593 nm 波长下测定样品液的吸光度，确定为还原力标准曲线。

1.2.6.2 添加抗氧化剂油茶籽油中多酚类物质的总抗氧化活性

取不同体积的待测样品液到刻度试管中，方法同1.2.6.1。以不加样品组为参照，测定样品吸光值，每个样品平行测定3 次，取平均值。根据还原力标准曲线，计算相同吸光值的FeSO4浓度，记为FRAP。

1.2.7 油茶籽油中酚类物质对DPPH 自由基的清除能力的测定[11]

在试管中依次加入3.0 mL 6.5×10-5mol/L DPPH溶液和1.0 mL 体积分数50%的乙醇，总体积为4.0 mL，混匀20 min 后，用1 cm 比色皿在517 nm 下测定，记为A0；加入3.0 mL 6.5×10-5mol/L DPPH 溶液和1.0 mL待测试样溶液，测定值记为Ai；加入3.0 mL50%乙醇和1.0 mL 样液，测定值记为Aj；重复测定3 次，结果取平均值。

计算DPPH 自由基清除率：清除率＝[1－（Ai－Aj）/A0]×100%。

1.2.8 油茶籽油中酚类物质清除羟基自由基的能力[12]

在10 mL 带刻度的试管中加入5 mL 蒸馏水、50 μL 0.02 mol/LFeSO4溶液、100 μL0.01mol/L 水杨酸溶液，最后加入50 μL0.02 mol/L 双氧水启动反应，放置在37 ℃水浴锅保温反应30 min，之后立即在510 nm 波长下测定吸光值，作为空白吸光值。同上，在刻度管中分别加入不同体积的待测样品液后，再加入50 μL 0.02 mol/L 双氧水启动反应，37 ℃水浴恒温30 min 之后测定吸光值，每个样品平行测定3 次，取平均值，作为添加样品后的吸光值。由下式得出对羟基自由基的清除率。

式中：A1为加入待测样品后的吸光值；A0为空白对照的吸光值。

1.2.9 油茶籽油中酚类物质清除超氧阴离子自由基的能力[13]

加入样品前：将pH8.2Tris-HCl 缓冲液和50 mmol/L邻苯三酚溶液在25 ℃恒温水浴锅中保温。取5 mL pH8.2Tris-HCl 缓冲液，加入50 μL50 mmol/L 邻苯三酚溶液，在混匀器上摇匀，在325 nm 波长下立即测定。以pH8.2 Tris-HCl 缓冲液为空白，每隔0.5 min 测定依次吸光值，计算出平均值A0。

加入样品后：取5 mLpH8.2Tris-HCl 缓冲液，加入待测样品液50 μL～250 μL、50 μL50 mmol/L 邻苯三酚溶液，在混匀器上摇匀，立即同上测定。以pH8.2Tris-HCl 缓冲液为空白，每个0.5 min 测定一次吸光值，计算出平均值A1。由以下式得出对超氧阴离子自由基的抑制率。

式中：A1为加入待测样品后的吸光值；A0为空白对照的吸光值。

1.3 数据分析

用Excel 软件对试验数据进行制图；用统计分析软件SPSS12 对试验数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 茶多酚对油茶籽油酸值影响

茶多酚对油茶籽油酸值影响见图1。

由图1 可知，油茶籽油的酸值随着贮藏时间的推移在一定时间后逐渐增加，添加茶多酚后油茶籽油的酸值比空白组大，且随着茶多酚添加量的增加，酸值增加的速度增大。添加TBHQ 组的酸值比空白组小。在（62±2）℃的贮藏温度下，贮藏第6 天，空白酸值为1.965 mg/g，茶多酚添加质量浓度为0.04 %组的为2.147 mg/g，比空白的酸值高0.282 mg/g，说明茶多酚不能减缓油茶籽油在（62±2）℃贮藏温度下的酸值变化。添加TBHQ 的油茶籽油在贮藏时间内，酸值变化很小，在贮藏第六天其酸值为1.731 mg/g，比空白组低0.234 mg/g，比0.04%TP 的低0.416 mg/g，茶多酚在抑制油茶籽油的酸值变化方面不如TBHQ。

图1 茶多酚对茶籽油贮藏过程中酸值影响Fig.1 The effect of TP on the acid value of camellia seed oil storaged

2.2 茶多酚对油茶籽油过氧化值的影响

茶多酚对油茶籽油过氧化值的影响见图2。

图2 茶多酚对茶籽油贮藏中过氧化值的影响Fig.2 The effect of TP on the changes of POV of camellia seed oil storaged

由图2 可知，添加茶多酚的油茶籽油的氧化抑制作用极显著比TBHQ 强（P＜0.01）。第7 天空白组的POV为82.643 meq/kg，添加质量浓度为0.02 %、0.03 %、0.04%TP 组为76.185、76.438、76.407、空白组的POV比茶多酚组高6.458、6.205 和6.236 meq/kg。比TBHQ组高4.734 meq/kg。抗氧化剂对油茶籽油的过氧化值的抑制作用大小比较为：0.02 %组＞0.04%组＞0.03 %组＞TBHQ 组。说明添加茶多酚能够抑制油茶籽油的过氧化值增大。

2.3 油茶籽油中酚类物质总含量

油茶籽油中酚类物质提取量见表1。

由表1 可知，油茶籽油中酚类物质的含量在贮藏前较高，在高温贮藏后，酚类物质明显降低。即降低量为：空白组＞TBHQ 组＞0.04%TP＞0.03%TP＞0.02%TP。说明，油茶籽油在贮藏期间抗氧化的酚类物质来源于两部分：油茶籽油中原有的酚类物质和添加的抗氧化剂中的酚类物质，且在抗氧化过程中，随着添加茶多酚的浓度的增加，损失率反而增大。

表1 油茶籽油中酚类物质提取量Table 1 The content of phenol extracted from camellia seed oil

2.4 添加不同抗氧化剂中多酚类物质总抗氧化的能力

通过FRAP 法，测得的多酚类物质总抗氧化能力见图3。

图3 茶多酚对油花籽油多酚类物质总抗氧化能力Fig.3 TP towards the total antioxidant capacity of polyphenol materials of camellia seed oil

随着油茶籽油样品中多酚类物质质量浓度的增加，其总抗氧化能力增强，多酚类浓度最高时，添加抗氧化剂空白、0.02%TP、0.03 %TP、0.04 %TP、TPHQ 油茶油油中总酚抗氧化能力分别为是289.103、253.462、359.615、409.615、503.718 μmol/L，TBHQ 的油茶籽油中多酚抗氧化能力最强，其次为0.04%TP，最差为0.02%TP。

2.5 茶多酚对油茶籽油中多酚类物质DPPH 清除率

茶多酚对油茶籽油中多酚类物质DPPH 清除能力见图4。

如图4 所示：烘后的清除率明显高于烘前的清除率，不添加抗氧化剂的油茶籽油中酚类物质对DPPH自由基清除率明显小于添加抗氧化剂的，同浓度的茶多酚处理的油茶籽油的DPPH 自由基清除率变化显著不同（P＜0.05）。空白组的清除率增长量为1.89%，0.02%TP、0.03 % TP、0.04 %TP 和TBHQ 的增长量分别为9.02%、10.08%、8.46%、2.8%。茶多酚处理的油茶籽油的DPPH 值大于TBHQ 组。这可能是在高温下，添加抗氧化剂的油茶籽油中的酚类物质含量升高，产生自由基的数量增多，清除DPPH 自由基的能力增强，故烘后油茶籽油的DPPH 清除率升高。

图4 茶多酚对油茶籽油中总酚清除DPPH 的能力Fig.4 TP towards DPPH radical scavenging capacity of the total phenol of camellia seed oil

2.6 油茶籽油中酚类物质清除羟基自由基的能力

油茶籽油中酚类物质清除羟基自由基的能力如图5 所示。

图5 茶多酚对油茶籽油中总酚清除OH－自由基的能力Fig.5 TP towards OH－radical scavenging capacity of the total phenol of camellia seed oil

随着酚类物质量的增大，其对羟基自由基的清除作用增强。在添加不同的量的抗氧化剂的实验组中，添加抗氧化剂比不添加抗氧化剂的清除率高，添加TBHQ 的清除率不如添加茶多酚的高。清除率比较为：0.02%组＞0.04%组＞0.03%组＞TBHQ 组＞空白组。在高温中，油茶籽油的氧化速度加快，产生·OH 的速度加快，单位时间油中产生的量增多，故出现油茶籽油中的清除羟基自由基的清除能力烘后比烘前高的现象。

2.7 油茶籽油中酚类物质清除超氧阴离子自由基的能力

油茶籽油中酚类物质清除超氧阴离子自由基的能力如图6 所示。

添加茶多酚的油茶籽油中贮藏后多酚类物质对超氧阴离子自由基的清除能力在一定范围内随着酚类物质的量的增加而增加。当添加的酚类物质体积在40 μL 时，高温贮藏后，空白组的抑制率为31.674%，0.02 %、0.03 %、0.04 %和TBHQ 组的抑制率分别为50.654%、15.894%、10.119%和25.980%。以0.04%TP处理组为最低，0.02%TP 处理组最高。一定浓度的TP处理，对清除超氧阴离子自由基有协同增效的作用。

图6 茶多酚对油茶籽油中酚类清除超氧阴离子的能力Fig.6 TP towards O2-·radical scavenging capacity of the total phenol of camellia seed oil

3 结论

油茶籽油的储藏稳定性受多种因素的影响。通过添加不同质量的茶多酚配制成质量浓度为0.02 %、0.03%、0.04%的油茶籽油，与添加质量浓度为0.02%的TBHQ 一起与空白组对照，放置在（62±2）℃的贮藏温度下，并比较贮藏后油中酚类物质的含量以及酚类物质清除自由基的效率，茶多酚对油茶籽油的酸值抑制作用不如TBHQ 的，且随着茶多酚添加量的逐渐增加，添加TBHQ 的油茶籽油的酸值变化较小，其酸值在贮藏期间一直小于不添加任何抗氧化剂的。茶多酚对油茶籽油的过氧化值的抑制作用比TBHQ 的强，其抑制作用比较为：0.02%TP＞0.04%TP ＞0.03%TP。

油茶籽油中固有的酚类物具有一定的抗氧化作用。在添加抗氧化剂的油茶籽油中，带入的抗氧化剂中抗氧化物质和油脂中原有的酚类物质具有相互作用的关系。添加TBHQ 的抗氧化效果不及茶多酚的。对羟基自由基、超氧阴离子、DPPH 的清除率，以添加茶多酚0.02%的油茶籽油抗氧化效果最好。

茶多酚是一种天然的抗氧化剂，其对人体的毒性较TBHQ 小，且其在价格方面较其他的天然抗氧化剂低。综合评价，茶多酚对油茶籽油的贮藏性能较好。

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