交叉引物等温扩增技术检测志贺氏菌

祁军，张霞，2，蒋刚强，蔡国瑞，董亚学，郑文杰，*

（1.天津出入境检验检疫局，天津 300461；2.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457；3.新疆出入境检验检疫局，新疆乌鲁木齐 830063）

志贺氏菌属（Shigella）的细菌是一类具有高度传染性的肠道致病菌，根据Igor G 等研究，在成年患者中，只要10 cfu～100 cfu 的志贺氏菌就可通过感染肠道而致病[1]，引发严重的炎症反应；在幼儿可引起急性中毒性菌痢，死亡率甚高。志贺氏菌主要通过食物或水经消化道传播，导致食源性志贺氏菌流行，与志贺氏菌病相关的食品包括色拉、生蔬菜、奶及奶制品、水果、肉类、面包制品等。志贺氏菌可以分为痢疾志贺氏菌（S.dysenteriae）、福氏志贺氏菌（S.flexneri）、鲍氏志贺氏菌（S.boy dii）和宋内氏志贺氏菌（S.sonnei）。在发展中国家，由福氏志贺氏菌引起的感染性腹泻疾病高居首位[2]。

国家标准对于食品中志贺氏菌的检测方法需要2 d～3 d 才能得到初步结果，而随着食品安全检测标准的提高，寻找更加快速、准确、便捷的检测技术显得至关重要。志贺氏菌的检测方法很多，ELISA、常规PCR检测、实时荧光定量PCR、环介导等温扩增、脉冲场凝胶电泳、RAPD、基因探针等技术均在志贺氏菌的检测和研究中得到广泛的应用[3-10]。

随着生物实验技术、免疫学技术以及分子生物学技术的发展，志贺氏菌的检测和鉴定方法朝着快速简便、灵敏性高、特异性强且经济的方向发展。本研究应用一种新的交叉引物等温扩增技术[11]，针对编码4 个血清型的志贺氏菌主要毒力基因——侵袭性质粒抗原H 基因（ipaH），建立一种既有分子生物学检测的高灵敏、高通量，又具有免疫学检测的特异性好、操作简捷，又不需要任何复杂仪器的快速检测方法，以适用于基层实验室和现场快速筛查检测。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

dNTPs（Fermentas），10×Bst buffer（New England Biolabs），Bst DNA polymerase large fragment（New England Biolabs），MgSO4（Sigma），betaine（Sigma），核酸快速检测试纸条（杭州优思达公司）。

菌株采用志贺氏菌6 株（4 株CMCC 菌株、样品中分离出的2 株野生株）及32 株其他相关阴性菌，详见表1。

1.2 主要仪器与设备

PCR 扩增仪（Biometra）、离心机（Eppendorf，5417R）、DNA/RNA/蛋白分析仪（BHIMUZDA，Bio Specmini）。

表1 试验菌株Table 1 Bacterial strains for detection

1.3 方法

1.3.1 DNA 的提取及定量

痢疾志贺氏菌CMCC 51252 为试验菌株，接种于10mL 营养肉汤中，37℃培养16h，取1mL 用于细菌基因组提取，利用紫外分光光度计检测DNA 质量及纯度。

1.3.2 引物及探针的设计

以志贺氏菌EU743831.1 的invasion plasmid antigen（ipaH2）基因DNA 序列为基础，设计引物序列：

1.3.3 反应体系和反应条件

通过优化，反应体系为：10×ThermoPol buffer 2 μL，10 mmol/L dNTP 0.8 μL，100 mmol/L MgSO40.6 μL，5 mol/L Betaine 2 μL，8U/μL Bst DNA pol 1 μL，2μmol/L SHIF3/SHIB3 0.5μL/0.5μL，20 μmol/LSHICPR20.6 μL，20 μmol/L SHIDF5F/SHIDF5B 0.5 μL/0.5 μL，模板1 μL，ddH2O 补足至20 μL。

反应条件：64 ℃反应60 min。

1.3.4 特异性试验

对表1 中菌株核酸样本进行试验，以证明检测方法是否具有通用性及特异性。

1.3.5 灵敏度试验

通过对过夜培养CMCC 51252 菌液取1 mL 做细菌计数，用PBS 对菌液进行10 倍梯度稀释至10-8，取1 mL 提取细菌基因组做实验模板。按照反应体系进行试验，试验重复六次。

1.3.6 干扰菌试验

取大肠杆菌43046，沙门氏菌50041，阴沟肠杆菌45301 共3 株菌作为干扰菌株，营养肉汤培养菌液浓度大约为108cfu/mL 左右，进行10 倍梯度逐倍稀释到浓度为107cfu/mL～101cfu/mL。

准备3 个锥形瓶，3 个瓶中接入终浓度分别为（1）103cfu/mL 51252+105cfu/mL43046；（2）103cfu/mL 51252+105cfu/mL50041；（3）103cfu/mL 51252+105cfu/mL 45301 3 种干扰菌混合。取1 mL 混合液提取DNA 做实验模板，按照反应体系进行试验。

1.3.7 实际样品检测

用该研究建立的检测方法体系与现有国家标准检测方法同时对来源于不同国家的不同种类食品的58 份实际样品进行普查检测，确定该检测体系的假阳性率及假阴性率，客观全面分析评估建立的检测体系可操作性及准确率。

2 结果与分析

2.1 特异性试验

检测38 株实验菌株，其中6 株志贺氏菌检测全部为阳性，图1 是志贺氏菌检测结果；其余32 株阴性相关菌检测为阴性，图2 为部分肠杆菌科其他阴性菌株的试验结果，说明该方法特异性良好,而且对于志贺氏菌检测具有很好的通用性。

图1 志贺氏菌特异性检测Fig.1 Specificity of detecting Shigella strains

图2 非志贺氏菌特异性检测Fig.2 Specificity of detecting for non-Shigella bacterial strains

2.2 灵敏度试验

2.2.1 纯菌液灵敏度检测

CMCC 51252 过夜菌液计数为7.3×108cfu/mL，用PBS 对菌液进行10 倍梯度稀释至7.3×101cfu/mL，各取1 mL 提取细菌基因组做实验模板，结果见图3，灵敏度达到103cfu/mL。

图3 志贺氏菌CMCC 51252 菌液灵敏度试验Fig.3 Sensitivity of detecting Shigella CMCC51252 in pure culture

2.2.2 干扰菌试验

对1.3.6 步骤的混合菌液进行检测，试验结果表明在干扰菌终浓度均达105cfu/mL 的情况下，检测灵敏度没有发生明显变化，依旧为达103cfu/mL。

2.3 实际样品检测

对58 份实际样品进行普查检测，金标准的传统生化检测结果阳性样品4 个，该检测方法阳性结果6 个，两种检测方法结果大致相符，新建立的方法没有漏检情况，有可能出现假阳性，但发生率较低，适用于样品检测初筛要求。

3 结论

随着食品安全检测标准的提高，寻找更加快速、准确、便捷的检测技术显得至关重要。志贺氏菌的检测方法随着检测技术的发展，将得到不断地改进和完善，并朝着快速简便、灵敏性高、特异性强且经济的方向发展。

近年来，以分子生物学为基础的微生物学检测得到较快发展，与传统检测手段相比，能更快发现食品中存在的微生物安全隐患。交叉引物结合免疫金标试纸条检测是一种新型的等温扩增检测方法，消除了PCR、实时荧光PCR 对仪器的依赖，同时与环介导恒温扩增法（LAMP）相比，其检测结果的观察更为直观、客观、便捷，只需依据试纸条上检测线的有无即可明确判定阴阳性结果，避免了环介导等温扩增使用肉眼观察沉淀或颜色变化的主观性。该方法不需要仪器设备及其高度灵敏、特异及快速的优点对于普及分子生物学方法在基层和经济不发达地区具有重要的意义。

本研究根据1987 年Buysse 等发现志贺氏菌侵袭性质粒抗原H（ipaH）[12]基因建立交叉引物恒温扩增方法，具有较好灵敏度。该基因呈多拷贝存在于菌体的质粒或染色体上，是志贺氏菌检测中常用到的目的基因。许龙岩等[13]根据ipaH 基因序列设计引物建立PCR方法，特异性高，能检测出志贺氏菌属的4 个种群；赵丽华等[14]利用分子信标PCR 方法以该基因为目的基因，检测样品准确率达到100%。本研究建立检测检测方法无论有无干扰菌，检测灵敏度均可稳定达到103CFU/mL 可满足样品检测需求。通过与金标准同时进行实际样品检测比较，结果大致相符，没有漏检情况出现，但有可能出现假阳性，发生率较低。实验结果表明，该方法操作简便，不需要特殊设备，适合于基层实验室对于样品的快速筛选检测。

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