自拟康肾口服液质量标准的建立

李献玉

康肾口服液由人参、生黄芪、白术、茯苓、淫羊藿、红花、金樱子、芡实等纯中药组成的复方制剂，具有补肾健脾，化瘀通络、固本涩精等功效，临床用于治疗慢性肾小球肾炎、肾功能不全，特别是脾肾两虚型慢性肾炎的治疗。为保证制剂的稳定性及疗效，本文对其质量标准进行了研究。对方中人参、黄芪、红花采用TCL法进行了定性鉴别，研究建立了高效液相色谱法测定羟基红花黄色素A（HSYA）含量的方法，并制定了相应的含量测定限度。本研究最终建立了准确高、重现性好、操作简易的质量标准方法，从而为康肾口服液的质量控制提供了可靠依据。

1 仪器与试剂

岛津LC-10A型高效液相色谱仪（SPD-10Avp紫外检测器，CTO-10Asvp柱温箱，LC-10Atvp双泵，N2000色谱数据工作站），色谱柱：DiamonsiLTM钻石 C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；Auto Science AS5150A 超声波清洗器；德国 Sartorius公司BP211D（十万分之一），BP121S（万分之一）电子天平。

对照品：羟基红花黄色素A（111637-200503）；对照药材：红花（批号120907-200709）均由中国药品生物制品检定所提供，乙腈为色谱纯（fisher公司），水为超纯水；其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 人参的薄层鉴别 取康肾口服液10 ml，水饱和正丁醇提取2次，20 ml/次，合并提取液，氨试液20 ml洗涤1次，蒸干正丁醇，用2 ml甲醇溶解残渣，作为供试品溶液。另取人参皂苷Rg1、Re对照品加甲醇制成1 ml各含0.5 mg的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，分别吸取上述两种溶液10 μl，分别滴于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-乙酸乙酯-水（4∶1∶5）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，在日光下显相同的棕褐色斑点。结果见图1。

2.1.2 黄芪的薄层鉴别 取人参鉴别项下的供试品溶液1～10 ml容量瓶中，甲醇稀释至刻度，作为供试品溶液。另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成1 mg/ml的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（附录Ⅵ B）试验，吸取上述两种溶液各10 μl，分别滴于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以 10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，在日光下显相同的棕褐色斑点。结果见图2。

图 1 人参的薄层鉴别

图 2 黄芪的薄层鉴别

2.1.3 红花的薄层鉴别 取康肾口服液，作为供试品溶液。另取红花对照药材0.5 g，加水10 ml，超声处理30 min、滤过，滤滚浓缩至干，残渣加无水乙醇，搅拌，静置，弃去无水乙醇，残渣加水1 ml使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液0.5 μl、对照药材溶液0.3 μl分别滴于同一硅胶 GF254薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水（6∶2.4∶5)为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的棕色斑点。结果见图3。

图 3 红花的薄层鉴别

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适用试验 色谱柱为Diamonsil C18（4.6×150 mm，5 μm），用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为乙腈-0.05%磷酸=12/88；流速为1.0 ml/min；柱温为30℃；检测波长为403 nm。理论板数按羟基红花黄色素A计算应不低于3000。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取羟基红花黄色素A对照品4.00 mg于25 ml容量瓶中，加25%甲醇溶解并稀释至刻度，制成160 μg/ml的标准品母液。

2.2.3 供试品溶液的制备 精密量取康肾口服液5 ml，于50 ml容量瓶中，加25%甲醇稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤即得。

2.2.4 方法学考察 阴性干扰试验：取处方中除去红花的其他药材，按供试品溶液制备工艺制成阴性供试品溶液。分别吸取阴性供试品溶液、对照品溶液和供试品溶液各20 μl，注入色谱仪。结果羟基红花黄色素A出峰时间为10 min，分离度为2.82，理论塔板数为6525，在与对照品色谱峰相应位置处无色谱峰出现，见图4。

图 4 羟基红花黄色素A

线性范围考察：精密量取 0.5、1、2、3、4、5 ml对照品母液置10 ml量瓶中，加25%甲醇稀释至刻度，摇匀，制成浓度为 8、16、32、48、64、80 μg/ml的对照品溶液，精密量取各20 μl，分别注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积（X）对进样浓度 （C，mg/ml）进行线性回归，回归方程为y=0.3543x-4.4449相关系数r=0.9998，结果表明，羟基红花黄色素A浓度在8～80 μg/ml范围内，峰面积与浓度线性关系良好。

精密度试验：精密吸取对照品溶液（48.00 μg/ml）20 μl，重复进样5次。试验结果表明：峰面积的相对标准差RSD<2%，说明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一批样品，按含量测定项下方法制备样品，得样品供试品溶液；取供试品溶液与对照品溶液，于0、1、2、4、8、24 h 分别进样，进样量 20 μl/次，记录峰面积值。试验结果表明，对照品及样品供试液在24 h内稳定性良好。

重复性试验：取同一批样品6份，分别按含量测定项下方法测定，计算含量。结果表明，样品平均含量为362.53 μg/ml，RSD<2%，所考察方法重复性良好。

加样回收率试验：取已知含量的样品 （含量365.24 μg/ml）5 ml，于 50 ml容量瓶中，加 25%甲醇稀释至刻度，摇匀。精密量取稀释液6份，每份5 ml置于50 ml容量瓶中，分别加入对照品溶液（48.00 μg/ml）2、2、4、4、6、6 ml，加 25%甲醇稀释至刻度，摇匀，进样20 μl，测定，计算回收率。6次试验的加样回收率测定结果均在95%～105%，其平均值为99.43%，RSD为1.16%。表明本方法可靠，符合含量测定的要求。结果见表1。

表 1 回收率试验结果

2.2.5 含量测定 按供试品溶液制备方法处理3批样品，对其含量进行了测定，每批平行测定2次。分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各20 μl，注入色谱仪，测定，记录峰面积，以外标法计算含量，结果分别为362.33、362.6、365.24、365.79、370.54、368.15 μg/ml。

3 讨 论

红花的鉴别，康肾口服液中红花为水煎煮，鉴别成分为水溶性成分，方法参考文献[1-5]对方中红花的薄层鉴别进行研究：最终选择了以水为溶剂超声处理30 min、滤过浓缩加无水乙醇，搅拌，静置，弃去无水乙醇，残渣加水1 ml溶解，作为对照药材溶液。

中国药典2005年版一部红花药材中有HSYA的HPLC测定方法，参照此法HSYA的峰形有较严重的拖尾现象，分离度也不理想，阴性样品有干扰。本研究在参照已有文献报道的基础上[6，7]，考察了不同比例的甲醇—磷酸水系统、乙腈-磷酸水系统，结果发现采用乙腈-0.05%磷酸水溶液（体积比12∶88）系统洗脱，HSYA峰形对称，与相邻峰达到基线分离，且方法学考察也满足实验分析要求，所建立的HSYA含量测定方法简便准确，重复性好，可用于红花药材及其复方制剂质量标准的控制。

康肾口服液3批样品HSYA含量平均值为365.77 μg/ml，考虑到药材的来源、炮制加工、制剂生产及贮存等因素，含量限度在3批均值的基础上下降20%左右，故正文暂定康肾口服液HSYA含量限度为300 μg/ml。本次标准研究，测定样品批数有限，故将含量限度暂定为HSYA不得低于300 μg/ml。

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[5]冯树倩，李映辉.舒胸片中红花及川芎的薄层鉴别[J].中国医药导报，2010，7(1)：60-61.

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