离子交换树脂对马尾松松针中莽草酸的分离纯化

陈 英，刘成国，2，*

(1.湖南农业大学食品科学技术学院，湖南长沙 410128;2.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南长沙 410128)

莽草酸为白色结晶粉末，化学名为3，4，5－三羟基－1－环己烯－1－羧酸，化学式为 C7H10O5，相对分子质量为174.15，化学结构式如图1。它易溶于水，在室温下100mL水中能溶解18g莽草酸粉末，溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等强极性溶剂，不溶于石油醚、苯和氯仿等溶剂，熔点为190℃左右。

莽草酸的分子结构中三个羟基、一个双键和一个羧基，是弱酸性的有机酸，可以成酯，也可以成盐，也能发生加成反应，具有手性异构体。它具有抗炎、镇痛作用、抗血小板聚集、抗癌、抗病毒等药理作用［1－3］。同时，它是合成多种物质的原料，如多种生物碱、吲哚衍生物、芳香氨基酸和手性药物(抗癌药、抗病毒药)等，是一种重要的天然活性产物。现在莽草酸因是抗禽流感H5N1和甲型H1N1流感有效药物的关键中间体而备受关注。

图1 莽草酸的化学结构式Fig.1 Chemical structure of the shikimate

目前，制药工业用的莽草酸主要采用有机溶剂萃取法和硅胶柱层析法提取分离。但这些方法存在溶剂消耗量大，分离时间长，成本高，操作安全性差等缺点。在现代分离技术中离子交换树脂被广泛的应用。为了寻找一中新型的、操作方便、成本低且实用的提取分离方法，本实验研究了4种离子交换树脂分离纯化马尾松松针提取液中莽草酸的效果，筛选出了效果较好的树脂类型，并进一步研究了该树脂动分离纯化马尾松松针提取液中莽草酸的最佳工艺参数，为从马尾松松针中提取分离纯化莽草酸实行工业化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

马尾松松针 采自湖南省郴州市临武县，采摘时间8月下旬;D301大孔树脂、331弱碱性阴离子交换树脂 安徽三星树脂科技有限公司;D101大孔树脂、717强碱性阴离子交换树脂、732强酸性阳离子交换树脂、无水乙醇、氢氧化钠、浓盐酸、磷酸溶液等均为分析纯 国药集团化学试剂有限公司。

一次性无菌注射器 圣光医用制品有限公司;希波氏一次性针头过滤器(0.45μm) 北京英伟达科技有限公司;Agilent LC1100高效液相色谱仪 安捷伦科技公司;DZKW－S－4电热恒温水浴锅 北京市永光明医疗仪器厂;SHZ－D(Ⅲ)循环水式真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料预处理 将新鲜成熟的马尾松松针采回后，筛选除去枯黄和病老的部位，清水洗净并沥干水分，放入(65±1)℃的烘箱内烘48h，自然冷却，粉碎过40目，贮藏于广口瓶内备用。

1.2.2 提取液的制备 准确称取经1.2.1节处理后的马尾松松针粉末7.50g，加入料液比为1∶30的22%的乙醇溶液，采用100W超声波15min辅助条件水浴提取马尾松松针中的莽草酸，提取温度为69℃，提取总时间为28min。然后抽真空过滤，将滤液用3.5mmol/L的磷酸溶液定容至250mL，此为马尾松松针提取液，经测定该提取液中莽草酸的质量浓度为1.5mg/mL，冷藏备用。该制备工艺参数是根据本实验室之前的实验结果。

1.2.3 树脂的预处理 离子交换树脂首先用饱和的食盐水浸泡22h，然后用去离子水洗至水相中无黄色杂志流出，阴离子交换树脂先用4%的氢氧化钠溶液浸泡4h，用去离子水洗至中性，接着用4%的盐酸溶液浸泡3h，用去离子水洗至中性，最后再用4%的氢氧化钠溶液浸泡6h，用去离子水洗至中性备用;阳离子交换树脂按先酸－碱－酸顺序浸泡处理，浸泡方法与阴离子交换树脂处理的方法相同。大孔树脂先用无水乙醇浸泡24h，然后用1份无水乙醇和3份去离子水混合物洗至不产生白色浑浊物后，用去离子洗净大孔树脂中的乙醇备用。

1.2.4 树脂型号的筛选

1.2.4.1 静态吸附率的测定［4］准确称取2.0g经1.2.3节处理后的吸干明水的4种不同型号的离子交换树脂分别放入4个250mL的具塞锥形瓶中，并分别精确加入50mL 1.2.2节的提取液，盖紧瓶塞，在25℃恒温条件下，置于摇床以100r/min振荡24h，使树脂充分吸附莽草酸后，过滤，分别测定滤液中莽草酸的质量浓度，按式1计算树脂对莽草酸的吸附量及式2计算树脂对莽草酸的吸附率［5］。

式中，Qt:吸附量(mg/g树脂);E:吸附率(%);C0:莽草酸溶液的起始浓度(mg/mL);Ct:平衡溶液中莽草酸的浓度(mg/mL);V1:加入提取液的体积(mL);M:离子交换树脂的质量(g)。

1.2.4.2 静态解吸率的测定［6］将吸附莽草酸达到平衡的树脂放入另外4个具塞锥形瓶中，分别加入100mL 3%的氢氧化钠溶液，置于恒温振荡器中振荡24h，温度为25℃，振荡频率100r/min，使莽草酸充分解吸。过滤，测定滤液中莽草酸钠的质量浓度，并按式3计算树脂的解吸率。

式中，E':解吸率(%);C:解吸液浓度(mg/mL);C0:吸附前莽草酸的浓度(mg/mL);Ce:吸附达平衡时莽草酸的浓度(mg/mL);V2:洗脱液体积(mL);V1:加入提取液的体积(mL)。

1.2.5 动态吸附－解吸实验

1.2.5.1 上样液质量浓度对动态吸附的影响 将按1.2.3处理好的331阴离子交换树脂装入层析柱中，柱床体积为5mL，分别将质量浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/mL的莽草酸提取液上柱，流速控制为2.0mL/min进行动态吸附，分别收集流出液，测定流出液中莽草酸的质量浓度，并计算不同质量浓度的上样液331阴离子交换树脂的吸附量。

1.2.5.2 上样液的流速对动态吸附的影响 将质量浓度为1.5mg/mL的莽草酸提取液上柱，分别控制上样液以 7.0、5.0、3.0、2.0、1.0mL/min 的流速通过层析柱进行动态吸附，并分别收集流出液，测定流出液中莽草酸的质量浓度，并计算不同流速经过的331弱碱性阴离子交换树脂的吸附量。

1.2.5.3 吸附泄漏曲线 将50mL的质量浓度为1.5mg/mL的莽草酸提取液，以2.0mL/min的流速通过层析柱，分段收集流出液，每段收集1BV即5mL，测定流出液中莽草酸的质量浓度，以流出液的柱床体积为横坐标，以流出液中莽草酸的质量浓度为纵坐标绘制吸附泄漏曲线。

1.2.5.4 解吸洗脱剂质量分数对动态解吸的影响树脂吸附饱和后，用2BV的去离子水以8.0mL/min的流速洗柱，然后分别吸取50mL 1%、2%、3%、4%的氢氧化钠溶液依次以2mL/min的流速通过层析柱，分别收集解吸洗脱液，测定流出液中莽草酸钠的质量浓度。

1.2.5.5 洗脱流速对动态解吸的影响 树脂吸附饱和后，用2BV的去离子水以8.0mL/min的流速洗柱，用2%的氢氧化钠溶液分别以8.0、4.0、2.0、1.0mL/min的流速对树脂柱进行洗脱，分别收集流出液，测定流出液中莽草酸的质量浓度，并计算不同洗脱流速对吸附饱和的331弱碱性阴离子交换树脂的解吸率。

1.2.5.6 洗脱曲线 树脂吸附饱和，用2BV的去离子水以8.0mL/min的流速洗柱后，加入50mL的2%的氢氧化钠溶液，以4.0mL/min的流速通过层析柱，分段收集流出液，每段收集1BV，测定流出液中莽草酸的质量浓度，以流出液的柱床体积为横坐标，以流出液中莽草酸的质量浓度为纵坐标绘制洗脱曲线。

1.2.6 莽草酸质量浓度的测定

1.2.6.1 98%的莽草酸标准贮备液的配制 精密称取98%的莽草酸标准品10.00mg，置于50mL的容量瓶中，加入3.5mmol/L磷酸水溶液溶解，冷却至室温定容，摇匀备用，贮备液浓度为200μg/mL。

1.2.6.2 莽草酸标准曲线的绘制 采用高效液相色谱仪测定莽草酸的含量，其色谱条件为［7］:色谱柱:Agilent C18柱(5μm，46mm ×150mm)，流速0.8mL/min，进样体积10μL，检测波长为215nm，柱温为25℃，流动相为3.5mmol/L磷酸水溶液，进色谱柱前，以甲醇平衡30min。

准确吸取1.2.6.1配制的标准贮备液0.50、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL 放入 10mL 的比色管中，3.5mmol/L磷酸水溶液定容，经0.45μm的微孔滤膜过滤后，分别进样，测定色谱峰峰面积，并以色谱峰峰面积纵坐标，对应标准品的浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.6.3 样品中的莽草酸的测定 精确吸取已预处理好的样品测试液10μL，分别进入高效液相色谱仪，测定色谱峰峰面积，从标准曲线中查出莽草酸的质量浓度。

1.2.7 莽草酸纯度和提取率的计算 将过量的732强酸性阳离子交换树脂加入收集的洗脱液中，置入恒温振荡器中振荡2h，温度为25℃，振荡频率100r/min，使洗脱液与732强酸性阳离子交换树脂进行充分的交换，过滤，滤液即为莽草酸的纯化液，测定纯化液的质量浓度，并将其冷冻干燥至质量恒定，准确称取干燥粉末适量(m1)mg，用3.5mmol/L的磷酸溶液定容后按1.2.6.3的方法测定莽草酸的含量(m2)mg，纯度计算公式见式4，得率计算公式见式5。

式5中，c1:上样液的中莽草酸的质量浓度(mg/mL);v1:上样液的体积(mL);c2:纯化液中莽草酸的质量浓度(mg/mL);v2:纯化液的体积(mL)。

1.2.8 统计分析 用SPSS软件对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 树脂型号的确定

考察了不同型号的树脂对莽草酸的静态吸附－解吸的影响，记录实验数据，数据分析结果如图2所示。

莽草酸为弱电解质，溶液中存在氢离子、莽草酸根子离子、莽草酸分子三个形式的物质，因而影响树脂的对莽草酸的吸附性能的因素很多，树脂的吸附形式与被吸附物质的性质相同或相似时吸附效果好，树脂比表面积大时它吸附量也跟着增大等，因此选择树脂时要将各种因素综合考虑。莽草酸的存在形式为离子和强极性分子，这有利于离子交换树脂的吸附。由图2可知，D301、D101这两个型号的大孔吸附树脂的吸附率很小，不适合马尾松松针提取液中莽草酸的吸附。强碱性阴离子交换树脂717对马尾松松针提取液中莽草酸的吸附率虽然比较高，但是它对马尾松松针提取液中莽草酸的解吸率比同样有着较高吸附率的弱碱性阴离子交换树脂331的解吸率要低，即717强碱性阴离子交换树脂对莽草酸的吸附力较大不易洗脱，因此选择331弱碱性阴离子交换树脂。

图2 不同型号的树脂对马尾松松针提取液中莽草酸的吸附率及解析率的比较Fig.2 Comparison of adsorption and desorption rates of different types of adsorption resins

2.2 331弱碱性阴离子交换树脂动态吸附－解吸条件优化的实验结果

2.2.1 上样液质量浓度对331阴离子交换树脂动态吸附的影响 测定不同上样液的质量浓度对331阴离子交换树脂对莽草酸的吸附性能的影响，记录实验数据，数据分析结果如图3所示。

图3 不同上样液的质量浓度对331阴离子交换树脂吸附量的影响Fig.3 Effect of shikimate concentration on the adsorption of 331 anion exchange resin

由图3可以看出，随着上样液的质量浓度的增加，331阴离子交换树脂对马尾松松针提取液中莽草酸的吸附量呈现先增加后缓慢的减少的趋势，当上样液的质量浓度在0.5～1.5mg/mL时，树脂的吸附量随着质量浓度增加而增加，当进一步增加上样液的质量浓度时，树脂的吸附量出现缓慢下降的趋势。原因可能是［8］，开始时莽草酸的质量浓度低时树脂没有全部进行吸附，随着质量浓度的增大，树脂逐渐吸附饱和，莽草酸分子之间的竞争吸附增强，而导致部分莽草酸分子没机会与树脂进行吸附交换就穿透流出，因而当质量浓度到达一定程度后再增加就会出现树脂的吸附量逐渐减少的现象，因此上样液的质量浓度不宜太高，所以上样液的质量浓度选择为1.5mg/mL较为合适。

2.2.2 上样液的流速对331阴离子交换树脂动态吸附的影响 测定不同上样液的流速对331阴离子交换树脂对莽草酸的吸附性能的影响，记录实验数据，数据分析结果如图4所示。

图4 上样液的流速对331阴离子交换树脂的吸附量的影响Fig.4 Effect of flow rate on the adsorption of 331 anion exchange resin

由图4可知，随着上样液流速的增加，331阴离子交换树脂对马尾松松针提取液中莽草酸的吸附量逐渐下降，其可能存在原因是［9］，随着流速的增加，上样液在树脂内的停留时间减少，固定相和流动相之间的相互作用不充分导致流动相中的莽草酸还没来得及跟树脂内表面接触就已经穿透流出，使吸附量变小，因此上样液的流速以慢速较为适宜，当流速为1mL/min时，树脂的吸附量最大，但流速太慢会延长分离纯化的时间，降低生产效率，不利于工业化生产，当流速为2mL/min时，树脂的吸附量从20.79mg/g下降到20.48mg/g，仅下降了0.31mg/g，但速度却提高了一倍，因此综合考虑，上样液的流速选择为2mL/min较为适宜。

2.2.3 吸附泄露曲线 考察上样液的体积对331阴离子交换树脂动态吸附的影响，记录实验数据，并绘制泄露曲线如图5所示。

图5 331阴离子交换树脂吸附莽草酸的泄漏曲线Fig.5 Breakthrough curve of shikimic acid from the Pine Needles on 331 anion exchange resin

一般情况下流出液中目标物质的质量浓度达到上样液中目标物质的质量浓度的1/10时，认为达到了该目标物质的泄露点［10］。在树脂的动态吸附中，上样液首先与层析柱上面的树脂接触，并先达到对目标物的吸附饱和状态，然后这种饱和状态逐渐向下移动，当所有树脂吸附到一定程度时，目标物开始泄露时，停止上样，这时达到了吸附的最佳过程［11］。由图5可知，当上样液的质量浓度为1.5mg/mL时，331阴离子交换树脂对马尾松松针提取液中莽草酸吸附的泄露点为4BV左右，所以331阴离子交换树脂吸附分离纯化1.5mg/mL马尾松松针的莽草酸提取液的最佳量为4BV，此时树脂的吸附达到最佳。2.2.4 洗脱剂的质量分数对331阴离子交换树脂洗脱性能的影响 考察不同解吸洗脱剂质量分数对331阴离子交换树脂动态解吸的影响，实验结果如图6所示。

图6 洗脱液氢氧化钠的不同质量分数对331阴离子交换树脂洗脱的影响Fig.6 Effect of eluent concentration on desorption rate of shikimic acid from the Pine Needles on 331 anion exchange resin

由图6可以看出，依次用50mL的1%和2%氢氧化钠溶液分别洗过装有吸附莽草酸饱和的331阴离子交换树脂的层析柱后，再用50mL的3%和4%氢氧化钠溶液分别洗脱时，洗脱液中没有检测到莽草酸的含量，说明2%氢氧化钠溶液对331阴离子交换树脂吸附莽草酸的洗脱效果较好，再进一步增加氢氧化钠的质量分数时并没有促进莽草酸的进一步洗脱，因此洗脱液氢氧化钠溶液的质量分数选择2%较为适宜。

2.2.5 洗脱流速对331阴离子交换树脂动态解吸的影响 测定洗脱剂的不同流速对331阴离子交换树脂对莽草酸的动态解吸性能的影响，记录实验数据，数据分析结果如图7所示。

图7 洗脱液的流速对331阴离子交换树脂的解吸率的影响Fig.7 Effect of flow rate of eluent on desorption rate of shikimic acid from the Pine Needles on 331 anion exchange resin

由图7可知，2%的氢氧化钠溶液的洗脱流速越快，331阴离子交换树脂对莽草酸的解吸率越低，这是因为在洗脱液体积一定的情况下，随着流速的增加，洗脱液在树脂内的停留时间减少，洗脱液还未充分萃取树脂吸附的莽草酸就已经穿透流出，使解吸率变小，因此洗脱液的流速以慢速较为适宜，但洗脱速度太慢会加长洗脱时间，所以应当综合考虑解吸率和洗脱时间来决定洗脱速度。由图7可看出，当流速为1mL/min时，树脂的解吸率最大，而洗脱液的流速为2～4mL/min时，树脂的解吸率下降的趋势不明显，从99.48%下降到98.63%，仅下降了0.85%，但速度却提高了4倍，因此综合考虑，洗脱液的流速选择为4mL/min较为适宜。

2.2.6 洗脱曲线 考察解吸液的体积对331阴离子交换树脂对莽草酸动态解吸性能的影响，记录实验数据，并绘制洗脱曲线如图8所示。

图8 331阴离子交换树脂吸附马尾松松针提取液中莽草酸的洗脱曲线Fig.8 Desorption curve of shikimic acid from the Pine Needles on 331 anion exchange resin

由图8表明，当洗脱剂2%的氢氧化钠溶液的量小于3BV时，随着洗脱剂用量的增加，流出液中莽草酸的质量浓度不断增加，当洗脱液的用量大于3BV时，随着洗脱液用量的增加，流出液中莽草酸的质量浓度逐渐减少，当洗脱液的用量达到8BV时，莽草酸基本被洗净。

2.3 莽草酸纯度的检测

马尾松松针提取液中的莽草酸经331阴离子交换树脂纯化后，测得纯化后莽草酸的纯度为90%，纯化过程中莽草酸的提取率为90.9%，较原提取液中莽草酸的纯度25%提高了3.6倍，说明331阴离子交换树脂对马尾松松针提取液中莽草酸的分离纯化效果较好，能大幅度提高马尾松松针提取液中莽草酸的含量。

3 结论

本实验采用树脂对马尾松松针提取液中的莽草酸进行了吸附－解吸实验，选出了对莽草酸吸附－解吸性能最佳的树脂，并对其动态吸附－解吸纯化工艺条件进行了研究。采用静态吸附－解吸法对4种不同型号的树脂进行筛选，确定了331阴离子交换树脂为纯化马尾松松针提取液中莽草酸的理想树脂。并对影响331阴离子交换树脂动态吸附－解吸效果的因素进行了优化实验，得到了331阴离子交换树脂纯化马尾松松针提取液中莽草酸的动态吸附－解吸的最佳工艺条件，结果表明，上样液的质量浓度为1.5mg/mL、上样液的流速为2mL/min、上样液体积为4BV条件下吸附，以2BV去离子水冲洗树脂柱、用8BV 2%的氢氧化钠溶液以4mL/min的流速洗脱时纯化效果最佳。经处理后的马尾松松针提取液中莽草酸的纯化提取率和纯度分别达到90.9%和90%，取得了较好的纯化效果。

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