白藜芦醇通过影响炎症因子保护LPS刺激后HUVEC细胞＊

孙玉红 章卓 李晓冰 王璐璐 肖顺汉

（泸州医学院药学院药理教研室，四川 泸州646000）

血管内膜的完整性是机体维持循环系统和组织器官局部内环境稳定的重要因素之一。多种因素如应激反应、心脑血管病、免疫反应、炎症反应等引起内皮损伤后，会引发或促进多种疾病的发生发展［1］。脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）是革兰阴性菌细胞壁主要成分，可导致血管内皮的炎症反应，进而造成血管内皮细胞损伤，是心脑血管疾病、糖尿病等疾病发生发展的主要病理因素和炎症反应过程的早期事件［2］。

白藜芦醇（Resveratro1，Res）是从多年生草本植物蓼科蓼属虎杖的根茎中提取的单体，分子式C14H12O3，研究显示，白藜芦醇对炎症有一定治疗作用［3］，但白藜芦醇对脂多糖损伤血管内皮有无保护效应目前尚不清楚，本课题通过观察白藜芦醇对LPS刺激人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）后细胞活力影响并观察对相应炎症因子的影响，探讨白藜芦醇对血管内皮的保护效应。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品与试剂

白藜芦醇（纯度98%，白色粉末，购自陕西森弗生物技术公司）；LPS（L2880，美国 Sigma公司，）；人IL－6、PGE2ELISA 检测试剂盒（Cayman化学公司）；低内毒素胎牛血清（杭州四季青公司）。

1.1.2 仪器

超净工作台（苏州净化设备有限公司，SW－CJ－1F型）；酶标分析仪（北京普朗新技术有限公司，DNM－9602型）；CO2培养箱（日本Sanyo公司，MCO－15AC型）；倒置相差显微镜（日本O－lympus公司，CKX41型）。

1.2 方法

1.2.1 白藜芦醇对HUVEC细胞和LPS刺激后 HUVEC细胞活力影响（CCK－8法）

HUVEC细胞使用含10%的胎牛血清、100U·ml－1青霉素、链霉素的RMPI－1640培养基，置于5%CO2、37℃培养箱中生长。调整细胞悬液浓度为5×104·ml－1，加入96孔培养板内，每孔200μl，将96孔板分为空白（培养基）、阴性对照（细胞＋培养基）、白藜芦醇1、5、10、50、100μmol·L－1组（细胞＋培养基＋药物）、LPS模型组（细胞＋培养基＋LPS，LPS终浓度0.1μg·ml－1）、白藜芦醇1、5、10、50、100μmol·L－1＋脂多糖干预组（细胞＋LPS＋培养基＋药物，LPS终浓度0.1μg·ml－1），每组均设3复孔。白藜芦醇在细胞置孵箱培养2h后共培养。采用CCK－8法，波长450nm处测定相应的吸光度（Absorbent，A）值，以吸光度值比较细胞活力情况。

1.2.2 白藜芦醇对LPS刺激后 HUVEC细胞分泌IL－6、PGE2的影响

调整细胞悬液浓度为1×106·ml－1，选择12孔板培养，置37℃、5%CO2孵箱培养12h，将12孔板分为阴性对照组（细胞＋培养基）、LPS模型组（细胞＋培养基＋LPS，LPS终浓度0.1μg·ml－1）、白藜芦醇1、5、10、50、100μmol·L－1＋脂多糖干预组（细胞＋LPS＋培养基＋药物，LPS终浓度0.1μg·ml－1），每组均设3复孔，处理后继续培养12h，每孔取200μl上清液，采取酶标法测定IL－6、PGE2。IL－6、PGE2的测定按试剂盒说明书进行操作。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 白藜芦醇对HUVEC细胞和LPS刺激后HUVEC细胞活力的影响

与阴性对照组比较，不同浓度白藜芦醇对正常HUVEC细胞活力并无影响（P＞0.05）。但给予0.1μg·ml－1LPS干预后，细胞活力明显下降（P＜0.05）。与LPS组相比，白藜芦醇各剂量组对HUVEC细胞活力均有明显提高（P＜0.05），见表1。

表1 白藜芦醇对HUVEC细胞和LPS刺激后HUVEC细胞活力的影响（±s）

表1 白藜芦醇对HUVEC细胞和LPS刺激后HUVEC细胞活力的影响（±s）

注：与模型组相比，＊P＜0.05；与阴性对照组相比，＃P＜0.05

组 别 浓 度 LPS未刺激（－） LPS刺激（＋）0.11±0.01 0.09±0.01阴性对照组 － 0.47±0.01 0.44±0.05 LPS组 0.1μg·ml－1 － 0.24±0.01＃白藜芦醇组 1μmol·L－1 0.42±0.01 0.32±0.01白藜芦醇组 5μmol·L－1 0.43±0.02 0.38±0.02＊白藜芦醇组 10μmol·L－1 0.42±0.02 0.39±0.02＊白藜芦醇组 50μmol·L－1 0.43±0.01 0.40±0.01＊白藜芦醇组 100μmol·L－1 0.44±0.01 0.41±0.02空白组 －＊

2.2 白藜芦醇对LPS刺激后HUVEC细胞分泌IL－6、PGE2的影响

正常 HUVEC细胞上清PGE2、IL－6含量较低，分别为579.3±5.6pg· ml－1和 61.8±6.1pg· ml－1。 给 予0.1μg·ml－1的LPS刺激后，PGE2、IL－6含量均显著增加，分别达4778.8±271.2pg·ml－1和1366.4±107.5pg·ml－1，同阴性对照组比较有显著差异（P＜0.05）。给予不同剂量白藜芦醇处理后细胞分泌PGE2、IL－6不同程度的减少，有一定的剂量依赖性，同模型组比较有显著差异（P＜0.05），见表2。

表2 白藜芦醇对LPS刺激后HUVEC细胞分泌IL－6、PGE2的影响（±s）

表2 白藜芦醇对LPS刺激后HUVEC细胞分泌IL－6、PGE2的影响（±s）

注：与模型组相比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与阴性对照组相比，＃＃P＜0.01

组 别 浓 度 PGE2（pg·ml－1） IL－6（pg·ml－1）－ 579.3±5.6 61.8±6.1 LPS组 0.1μg·ml－1 4778.8±271.2＃＃ 1366.4±107.5＃＃白藜芦醇＋LPS组 1μmol·L－1 3789.2±112.5 1050.2±95.2白藜芦醇＋LPS组 5μmol·L－1 2792.3±61.4＊ 850.6±87.2＊白藜芦醇＋LPS组 10μmol·L－1 2492.3±121.5＊＊ 642.6±67.4＊＊白藜芦醇＋LPS组 50μmol·L－1 2297.2±137.5＊＊ 450.7±64.2＊＊白藜芦醇＋LPS组 100μmol·L－1 2143.2±137.1＊＊ 478.4±31.1阴性对照组＊＊

3 讨论

白藜芦醇为天然提取物，无色针状晶体，难溶于水，易溶于乙醇、乙酸乙酯、丙酮等极性较强的溶剂。白藜芦醇具有抗肿瘤、保护心血管、抗炎和神经保护作用等多种药理学效应［3－5］。本实验经过预试将白藜芦醇溶于无水乙醇（最终细胞内浓度小于0.1%）中，使其即可达到助溶，又不会对细胞因子的释放产生影响。

目前认为，血管内皮细胞的完整对于机体维持循环系统和组织器官局部内环境稳定非常重要。但在炎症反应中，尤其是LPS刺激可以引起内皮损伤后，进而造成血管内皮细胞损伤，是心脑血管疾病发生发展的主要病理因素。目前越来越多的研究显示白藜芦醇是心血管保护作用的主要功能因子。体外试验证实白藜芦醇可以抑制血小板功能和内皮细胞TF的表达，从而减少血栓形成［6］。体外试验还证实白藜芦醇由于抑制了类花生酸的合成和血小板钙通道，从而抑制了由血栓素、ADP和胶原诱导的血小板聚集［7］。IL－6、PGE2是参与炎症反应的两种最重要的因子，在炎症过程中发挥重要的作用［8－10］，因此本实验选择这两个因子作为指标观察白藜芦醇对LPS刺激HUVEC的影响。

为了排除白藜芦醇本身是否具有细胞毒性以及对细胞因子作用与细胞毒有关，本研究检测了白藜芦醇对HUVEC细胞活力的影响，比较在LPS未刺激和刺激情况下的差异。结果显示不同浓度白藜芦醇对正常HUVEC细胞活力并无影响，但可明显提高LPS刺激后HUVEC细胞活力。另外模型组细胞培养上清IL－6、PGE2检测结果明显高于正常组，而白藜芦醇各干预组可以明显降低IL－6、PGE2表达，因此，我们认为白藜芦醇可以保护HUVEC细胞，提高对LPS刺激的耐受能力，此作用可能与抑制炎细胞因子TNF－α和IL－6的释放有关，并非白藜芦醇细胞毒作用所致，这为白藜芦醇用于心血管疾病以及糖尿病大血管病变等疾病的治疗提供了理论依据。白藜芦醇是否干预其他炎症因子或其他途径保护血管内皮作用尚有待进一步实验证实。

1 Liu D，Zhang D，Scafidi J，et al.C1inhibitor prevents gram－negative bacterial lipopolysaccharide－induced vascular permeability［J］.Blood，2005，105（6）：2350－2355.

2 郝钰，赵斌，郭钰琪，等.脂多糖诱导小鼠内皮损伤早期T细胞亚群的变化［J］.中国免疫学杂志，2011，27（6）：488－452.

3 孟雪莲，杨静玉，吴春福.白藜芦醇的药理学作用研究进展［J］.沈阳药科大学学报，2008，25（S）：51－54.

4 Mikua－Pietrasik J，Kuczmarska A，Kucińska M，et al.Resveratrol and its synthetic derivatives exert opposite effects on mesothelial cell－dependent angiogenesis via modulating secretion of VEGF and IL－8／CXCL8［J］.Angiogenesis，2012，15（3）：361－376.

5 Zong Y，Sun L，Liu B，et al.Resveratrol inhibits LPS－induced MAPKs activation via activation of the phosphatidylinositol 3－kinase pathway in murine RAW 264.7macrophage cells［J］.PloS One，2012，7（8）：e44107－e44120.

6 Pendurthi UR，Rao LV.Resveratrol suppresses agonist－induced monocyte adhesion to cultured human endothelial cells［J］.Thromb Res，2002，106（4－5）：243－248.

7 Dobrydneva Y，Williams RL，Morris GZ，et al.Dietary phytoestrogens and their synthetic structural analogues as calcium channel blockers in human platelets［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2002，40（3）：399－410.

8 Houser KR，Johnson DK，Ishmael FT.Anti－inflammatory effects of methoxyphenolic compounds on human airway cells［J］.J Inflamm（Lond），2012，9（6）：1－12.

9 Hashizume M，Hayakawa N，Suzuki M，et al.IL－6／sIL－6Rtranssignalling，but not TNF－alpha induced angiogenesis in a HUVEC and synovial cell co－culture system［J］.Rheumatol Int，2009，29（12）：1449－1454.

10 刘佳，尚文斌.白藜芦醇治疗2型糖尿病及其相关疾病作用的分子机制研究进展［J］.南京中医药大学学报，2010，26（2）：158－160.