HPLC－ELSD测定芪黄颗粒中的黄芪甲苷

崔春利 王 梅 郭东艳 唐志书 陕西中医学院（咸阳712046）

芪黄颗粒为陕西中医学院附属医院运用现代中西医结合理论在总结历代名家治疗的基础上，结合多年临床实践经验而研制的中药复方颗粒，处方由黄芪、川芎、桑寄生、牛膝、牡丹皮、黄连、天麻等16味中药组成，具有益气养阴、化瘀清热之功效，用于气阴两虚、瘀热内阻所致的疲乏气短、心悸失眠、胸胁闷痛、腰膝酸软、手足麻木、二便不调等症，高血压、冠心病、心功能不全、心律失常、高血脂等症。方中黄芪补脾肺之气，以益生血之源，为方中君药。现代研究表明，黄芪主含黄酮，皂苷及多糖类成分，具有提高免疫、促进胃肠运动、利尿与抗肾损伤、促进造血、延缓衰老、抗肝损伤、降血糖、降血脂、降血压等作用［1］。原制剂没有选择君药进行含量控制，为了更好的控制本品质量，拟采用高效液相色谱－蒸发光散射检测法，对本制剂中君药黄芪有效成分黄芪甲苷进行含量测定。本研究结合文献［2，3］采用 HPLC－ELSD 法对本制剂中黄芪甲苷进行含量测定，取得了满意的结果。本法操作简便，重复性好，测定结果准确可靠，可作为本制剂的质量控制方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters 2695高效液相色谱仪，Waters 2695泵，Waters 2996二极管阵列检测器，Empower色谱工作站（美国 Waters公司）；GB－204电子天平（瑞士梅特勒－托利多公司）。

1.2 试药 黄芪甲苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号110781－200613），芪黄颗粒（陕西中医学院附属医院制剂中心提供，批号20110630，20110702，20110704），乙腈为色谱纯，水为双蒸水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：依利特Hypersil C18（250mm×4.6mm，5μm）；柱温：室温；流速：1.0mL／min；增益125，雾化室温度50℃，漂移管温度36℃，流动相：乙腈－水（32∶68）。

在此条件下，理论板数分别以黄芪甲苷峰计算为5200，芪黄颗粒样品中黄芪甲苷与相邻杂质峰均达到基线分离，缺黄芪的空白制剂样品在黄芪甲苷峰处均无吸收，不干扰本品的测定。

2.2 对照品溶液的制备 取黄芪甲苷对照品各适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含黄芪甲苷0.518mg对照溶液，摇匀，即得。

2.3 供试品溶液的制备 取装量差异下的本品内容物，研细，取约30g，精密称定，置索氏提取器中，加入甲醇40mL，冷浸过夜，再加甲醇适量，加热回流4h，提取液回收溶剂并浓缩至干，残渣加水10mL，微热使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取4次，每次40mL，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40mL，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.4 标准曲线及线性范围 精密吸取黄芪甲苷对照品溶液（浓度为：0.518mg·mL－1）2，4，6，8和10μL，按上述色谱条件注入色谱仪，测定峰面积。以进样质量的常用对数X为横坐标峰面积的常用对数Y为纵坐标，绘制标准曲线，计算得回归方程为：Y＝1.3267X＋5.2842，相关系数r＝0.9993。结果表明，黄芪甲苷在1.036～5.18μg范围内线性关系良好。

2.5 精密度实验 取20110630批制剂样品供试品溶液，并依据上述色谱条件，精密吸取该样品溶液10μL，重复进样5次，记录峰面积，结果RSD为1.99%，表明本方法精密度良好。

2.6 重复性实验 取20110630批制剂样品6份，按供试溶液制备方法，制备样品溶液，并依据上述色谱条件，精密吸取各样品溶液10μL，进样，记录峰面积，结果含量分别为：50.25，49.25，50.52，47.75，49.05和50.08μg／g，平均含量为49.48μg／g，结果RSD为2.07%，表明本方法重复性良好。

2.7 稳定性实验 取20110630批制剂样品按供试品溶液制备方法，制备样品溶液，并依据上述色谱条件，分别于制样后0，2，4和8h，吸取该样品溶液10μL，进样、测定，记录峰面积，结果RSD为1.41%，表明本品在8h内稳定性良好。

图1黄芪甲苷对照品、样品、阴性样品高效液相色谱图

2.8 回收率实验 取一定量已知含量的20110630批制剂样品（C＝49.48μg·g－1）6份，分别加入黄芪甲苷对照品各适量，依法制备供试品溶液。按上述色谱条件，精密吸取各供试品溶液10μL，注入色谱仪，测定峰面，并计算含量及回收率，结果见表1。

表1 黄芪甲苷回收率试验结果

结果表明，本方法回收率良好。

2.9 样品测定 取该制剂3批，各按供试品溶液制备方法，制备样品溶液，并依据上述色谱条件，分别精密吸取各样品溶液10μL，进样，记录峰面积，结果3批芪黄颗粒中黄芪甲苷含量分别为61.24，57.00和56.42μg／g。

3 讨论与小结

黄芪甲苷在紫外区为末端吸收，吸收波长一般为203nm，采用紫外检测器检测，受试剂影响较大，操作条件非常严格，响应峰面积信号较小，特别是复杂的中药复方制剂芪黄颗粒，噪音对检测结果影响更大，紫外检测几乎看不到样品峰。为此，采用了通用性质量浓度型检测器ELSD来检测，聚焦待测物质的量，样品液中试剂被全部蒸发不干扰检测，试验结果灵敏度，稳定性及重复性均符合含量测定要求。

供试品溶液制备时，笔者考察了“先加水溶解再行水饱和正丁醇萃取法”与“先加甲醇回流提取，转溶于水相，再行水饱和正丁醇萃取法”，实验结果显示后者含量显著高于前者，故最终选用文中制备方法。

色谱条件摸索过程中，先后选择热电Hypersil C18（250mm×4.6mm，5μm）Accurasil C18（250mm×4.6mm，5μm）及和依利特 Hypersil C18（250mm×4.6mm，5μm）型的色谱柱，结果色谱分离效果不佳，故最终选用该型号色谱柱。

［1］国家药典委员会.中国药典［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：283－284.

［2］张 彤，黄顺旺.HPLC－ELSD测定前列舒乐颗粒中黄芪甲苷［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17（7）：82－83.

［3］薛巧如，翁雪萍，梁蔚阳.HPLC－ELSD测定前列通片中黄芪甲苷的含量［J］.中成药，2007，29（10）：1558－1560.