涡虫的基因沉默作用

吴雪 袁金铎 赵楠楠 杨桂文 安利国

（山东师范大学生命科学学院 山东省动物抗性生物学重点实验室，济南 250014）

基因沉默（Gene silencing）作为生物学研究的新领域，吸引了无数生物学家的眼球，在近20年间有许多关于这一方面的研究及假说被提出。基因沉默现象最早是Napoli 等发现，他们在进行转基因紫牵牛花的研究中意外发现白色花和杂色花表型，后来证实该表型是由转基因诱导植物体内基因功能缺失所致，当时称这种现象为共抑制。1995年，Guo等［1]在对秀丽新小杆线虫进行反义RNA技术的研究时，也出现了同样的抑制现象。直至1998年，Fire等［2]将dsRNA导入线虫体内，检测该dsRNA对线虫的影响，结果证实外源dsRNA会使特定基因沉默，并且该沉默作用具有遗传特性。他们将这种现象定义为RNA干扰作用（RNA interference，RNAi），也称为转录后基因沉默作用（Post transcriptional genesilencing，PTGS）。

在发现 RNAi作用后的几年间，该技术作为热点课题在多种生物中开展研究。在真菌、果蝇 、拟南芥等生物体内相继发现了RNA i现象的存在［3]。1999年，再生模型涡虫体内也发现了相同的基因沉默作用［4]，自此，RNAi作为一项能有效诱导特定基因功能缺失的新兴技术，在涡虫发育生物学和分子生物学的研究中发挥重要作用。近年，科学家研究发现内源性小RNA同样可以引起涡虫的基因沉默现象——miRNA、piRNA［5]，这种内源性基因沉默作用涉及涡虫生命活动的整个过程，如胚胎发育、干细胞维持、组织再生和配子形成等等，是涡虫维持正常生命活动所必须的调控过程。但目前对于miRNA、piRNA的作用机制还不是很清楚，尚需进一步试验研究来证实。

1 涡虫RNA干扰作用

1.1 RNA干扰机制

近年来对于RNAi技术的研究发现，在此过程中主要有几个控件发挥着重要作用，使得RNA干扰赖以发生。（1）双链RNA（double stranded RNA，dsRNA）——触发分子；（2）干扰性小RNA（small interfering RNA，siRNA）——重要效应分子；（3）RNaseⅢ家族核酸酶（Dicer，DCR）——dsRNA剪切酶；（4）RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）—— 沉默诱导物；（5）RNA依赖的RNA聚合酶（RNA directed RNA polymerase，RdRP）——级联放大效应酶。RNAi 发生机制大致分为3个阶段，即启动阶段：dsRNA进入生物体内，会被细胞内的Dicer酶识别并在ATP供能的条件下剪切成长约 21-24个核苷酸（Nucleotide，nt）的片段，即siRNA。效应阶段：siRNA与 Dicer酶、Argonaute蛋白家族等分子结合形成RISC，但此时的RISC处于无活性状态，无活性的RISC需在核酸内切酶 Ago-2的作用下使siRNA解旋，解旋后的反义链RNA将作为“向导”指导RISC识别靶mRNA。最终，RISC在Ago-2协助下降解靶mRNA，引发基因沉默［3，6]（图1）。 级联放大系统：由Dicer酶切割而成的siRNA除了与作用因子结合形成RISC之外，还能在RdRp的作用下，以靶mRNA为模板合成dsRNA，这些新合成的dsRNA最终也可被剪切成大量的siRNA，从而放大由siRNA引发的基因沉默作用，因此即使是很微量的dsRNA也能产生比较彻底的基因沉默效应［7，8]。

1.2 RNA干扰技术在涡虫中的发现

涡虫以其惊人的再生能力闻名于世，早在1989年，Morgan等［9]就已发现即使将涡虫切成279段，其每一截段也可以再生成一个完整的个体，证实了涡虫强大地再生能力。除此之外，涡虫作为具有三胚层、左右对称、头部集中化等特性的最简单生物体，在后生动物的进化过程中占据重要地位［10]。在过去的一个世纪里，涡虫作为经典的模型生物，为后生动物乃至人类生物学难题的解答提供了重要的参考依据，尤其是涡虫再生机制的研究，对于脊椎动物再生模型的建立具有重要意义［11]。但是由于缺乏行之有效的技术，涡虫的很多相关研究只局限在形态学和细胞学水平上，无法深入展开，因此科学家们花费大量的精力探索新的技术用于涡虫的深入研究。

1998年，科学家们在比涡虫高等的线虫中发现了RNAi作用，主要通过dsRNA注射法进行干扰。为了检测这种方法是否会在涡虫体内引发同样的基因沉默现象，Alvarado等［4]选取了体壁肌肉组织、具纤毛的腹部上皮组织、光感受器3个涡虫易于检测的代表性部位进行RNAi测定试验。研究结果表明：dsRNA注射法在涡虫体内会引起同样的基因沉默效果；dsRNA注射法在涡虫体内所引发的基因沉默效应是特异的；dsRNA在涡虫体内通过降解靶mRNA致使基因功能丧失。Alvarado的试验结果作为一个强有力的证据，证实了RNAi技术在涡虫体内发挥的强大功效，为RNAi技术在涡虫生物学研究中的应用奠定了基础。

随着RNAi作用在涡虫中的发现，很多科学家对该领域产生了浓厚的兴趣。他们尝试用一些改良的方法来诱导涡虫体内的基因沉默作用，如dsRNA饲喂法和siRNA浸泡法，都较为成功的起到了基因干扰作用［10]。在之后的10多年时间里，dsRNA注射法与dsRNA饲喂法作为涡虫RNAi技术的主要方法，在涡虫基因功能和再生机制的研究中发挥着无法替代的作用。

1.3 RNA干扰技术在涡虫中的应用

RNAi技术的应用，克服了涡虫研究技术的局限性，为涡虫基因功能的研究准备了条件。2005年，Reddien等［12]在EST库的基础上，结合RNAi技术，建立了第一个以siRNA干扰基因功能为基础的涡虫RNAi基因筛选文库。这一文库的建立为涡虫更好地作为模型生物在发育生物学研究中发挥作用奠定了基础，同时也掀起了涡虫基因水平研究的新高潮，此后，科学家们积极开展涡虫RNAi的相关研究。

1.3.1 涡虫RNAi多样化表型的确定 Reddien等［5]建立的RNAi基因筛选文库中，对瑞士种涡虫进行代表性取样，选取53 400个涡虫截段，干扰1 065个基因，共筛选出240个代表性表型类别，用于涡虫再生和稳态的研究。对这240个基因进行分析发现，其中的大部分基因在进化上存在高度的保守性——205个（85%）基因在其他生物体的基因组中发现了序列相似的同源基因。例如，涡虫中有38个基因的编码序列与人类某些疾病的引发序列存在同源性，在涡虫中对这些基因进行深入研究，有望开发出治疗人类相关疾病的药物，并且涡虫特定基因干扰表型易于获得，这也为相关疾病基因的研究提供了便利的条件。另外，还有35个无任何进化保守性的涡虫基因，这些基因被认为是扁形动物维持自身生命活动所必需的看家基因，在很多扁形纲的病原虫中这些基因也起至关重要的作用。因此可以针对这些已知的病原基因，设计相应有效的生物制剂，用于疾病的防御和治疗。涡虫RNAi多样化表型的确定，是涡虫基因功能研究的先决条件，为特定疾病的控制和治愈提供了有效信息，为疾病的检测技术提供了强大后盾［13]。

1.3.2 RNAi在涡虫neoblast研究中的应用 Neoblast即涡虫成体干细胞，主要存在于涡虫的间充质区，是涡虫体内唯一具有增殖分裂活性的细胞，涡虫的neoblast占其细胞总数的20%以上，因而可作为模式生物用于干细胞的研究［14]。在RNAi机制被发现之前，主要是通过紫外照射法特异性杀伤neoblast，但紫外线的杀伤作用具有非特异性，因此无法对neoblast的特定基因进行专门研究。而Reddien［5]通过RNAi作用筛选出导致neoblast表型异常的基因——异常表型与紫外照射的涡虫截段表型相似。再对这些筛选出的基因进行分组干扰试验，从而确定出neoblast发生相关的关键基因：smedwi-2和smedwi-3［15]。近年，Salvetti等［16]用相同的RNA干扰方法在涡虫体内检测到果蝇Pumilio的同源基因DjPum，该基因对于neoblast数量和形态的维持起重要作用。Guo等［17]将涡虫干细胞中的Bruno-like基因干扰后，neoblast将不能进行自我更新。除此之外，在瑞士种涡虫中还发现vasa、piwi、tudor和nanos的同源基因，这些基因功能的缺失会引起neoblast数量的明显减少，表明它们是维持neoblast活性所必需的［18]。neoblast相关基因的发现为成功分离和培养涡虫干细胞准备了条件，为人类更好地了解干细胞的调控机制提供了有价值的线索［19]。

1.3.3 RNAi在涡虫再生研究中的应用 涡虫的再生过程主要伴随着胚基发生和neoblast分化而进行，所有与neoblast的发生分化相关的基因在涡虫的再生过程中都起着重要作用，除此之外，再生过程中还涉及很多其他基因的相互作用，是一个非常复杂的基因调控过程。将RNAi文库中已鉴定出的240个干扰表型，按截段的再生阶段和胚基大小进行分类，针对各分类表型中的相应基因进行功能测定，从而确定出再生过程中各阶段的关键作用因子。Cebrià等［20]通过干扰roboA基因，发现神经系统在调控涡虫前端形态发生过程中起关键作用，神经系统相关基因干扰后，出现前端再生异常表型。Lapan［21]发现涡虫眼点再生过程中的关键调控因子——ovo，OVO缺少时涡虫无法形成正常的眼点结构。FGF-like受体nou-darake基因被认为可能与涡虫头部再生有关，该基因敲除后，可诱导涡虫的其他部位形成异位的大脑和眼点［22]。此外，Kobayashi和Iglesias等［23，24]通过对DjwntA基因的干扰作用证实：Wnt在涡虫再生过程前后轴极性的确立中起关键作用，并且发现了DjwntA和nou-darake/FGFR信号通路间的相互作用。通过分析这些已确定的再生因子，科学家们正逐步建立起涡虫的再生模型。该模型的建立有助于阐明高等动物细胞分化及器官再生的分子机制，将给人类疾病的治疗、组织器官损伤的修复带来新的希望。

2 涡虫内源性基因沉默

2.1 miRNA介导的内源性基因沉默

近年，在涡虫中发现另一条引发基因沉默的途径。该途径的主要效应因子为miRNA（microRNAs）：miRNA与siRNA同为20-25 nt单链小分子RNA，但与外源性干扰siRNA所不同，miRNA是由内源性具发夹结构的 pre-miRNA 加工而成，因此该过程又称为内源性基因沉默作用。基因组中位于内含子或基因间隔区的非编码基因经RNA聚合酶Ⅱ转录形成pri-miRNA，pri-miRNA在Drosha及其辅助因子DGCR8/PASHAR的作用下去除帽、尾结构成为pre-miRNA［25，26]，再经Dicer 酶切割成 20-25 nt的miRNA：miRNA*配对分子，最终成熟的miRNA 从miRNA：miRNA*双体中分离出来，与Argonaute蛋白结合形成沉默诱导复合体并进行靶基因识别，从而诱发内源性基因沉默作用［27，28]。近来的研究结果表明，miRNA 在转录后调控中起着至关重要的作用，miRNA介导的内源性基因沉默作用涉及涡虫生命活动的整个过程，如胚胎发育、形态发生、干细胞维持及组织再生等是涡虫维持正常生命活动所必须的调控过程［29]。

涡虫体内已发现了多种基因，它们与其他物种中编码miRNA发生相关蛋白的基因同源，当被敲除时会导致涡虫再生过程的异常，表明miRNA在涡虫再生和neoblast维持过程中是必须的。例如，Ago-2作为涡虫形成沉默诱导复合体的必需蛋白，被RNAi技术沉默后，不仅阻碍了再生过程，而且neoblast的数量也出现了明显的下调［30，31]。目前，在瑞士种涡虫中已鉴定出很多保守的miRNA和miRNA簇，预测这些miRNA在涡虫中具有相似功能。对涡虫miRNA进行高通量测序，发现了两类miRNA：strain-specific miRNA和neoblast-specific miRNA［32]。

2.1.1 strain-specific miRNA 瑞士种涡虫具有有性品系和无性品系两种，有性品系成熟个体同时具有雌性生殖系统和雄性生殖系统，即雌雄同体。而无性品系缺少成熟的生殖器官，只能进行裂体生殖。Newmark［9]对两品系进行核型分析，发现无性品系中的染色体易位现象可能是导致其无法产生成熟生殖器官的根本原因。通过高通量测序对两品系的miRNA进行分析，寻找出很多品系特异miRNA，其中大部分的无性品系miRNA为涡虫所特有的［33]。虽然这些特异miRNA与染色体易位现象间的关系还不是很清楚，但可以确定它们确实在涡虫品系分化中发挥作用，这些miRNA的发现为涡虫生殖模型的建立准备了条件。

2.1.2 neoblast-specific miRNA 通过对紫外处理组和非处理组涡虫miRNA进行高通量测序，鉴定出许多在neoblast中特异表达的miRNA。例如，miRNA簇mir71a/2d/13/752中的41个miRNA进行整体原位杂交，杂交痕迹主要定位在神经系统和上皮组织的neoblast中［33，34]。涡虫中有斑马鱼mir-133的同源基因，Wnt 和Fgf是该基因的主要作用靶点——它们是涡虫伤口愈合、干细胞再生及前后轴极化所必需的［35]。最近的研究显示，涡虫miRNA可能在中枢神经系统发育过程中起重要作用，因为很多涡虫miRNA的作用靶点是中枢神经系统再生过程中的关键因子，但这些特异miRNA对神经链接进行再生修复的调节机制还不清楚。

2.2 piRNA介导的内源性基因沉默

2006年，《Nature》和《Science》杂志同时刊载了关于piRNA分子的报道。piRNA是一种26-31nt组成的内源性单链小RNA，主要分布在转座子、重复序列等区域。可通过Piwi-piRNA复合物引起基因沉默从而调控生殖细胞的生长发育过程，是多种生物生殖发育得以顺利进行的重要保障［36-38]。piRNA最早在雄性小鼠睾丸中发现，这些小RNA特异地与Piwi 蛋白家族的成员相互作用，因而被命名为 Piwiinteracting RNAs，即 piRNAs［39]。随后，Reddien在涡虫中也发现了piRNA。它们可与涡虫的Piwi同源蛋白Smedwi-2、Smedwi-3相互作用。Smedwi蛋白家族在维持涡虫干细胞性能中起作用，piRNA可通过沉默Smedwi-2、Smedwi-3的表达来完成对干细胞形态数量的调控［15]。涡虫piRNA在染色体上的分布位置具有保守性。同时，其形成过程也遵循其他物种所适用的“乒乓模型”（ping pang model）假说。2008年，Palakdoeti［15]证实，涡虫piRNA确实具有与其他物种piRNA相似的功能，即piRNA在涡虫生殖干细胞命运决定、减数分裂、精子发生等配子形成事件中发挥重要作用［34]。目前，对于涡虫piRNA的研究较少，对其分子特征及作用机制还不是很清楚。有人认为，piRNA能通过表观遗传调控及转录后调控的方式发挥基因沉默作用［40，41]，但尚需进一步探究考证。

3 结语

RNA干扰技术在涡虫的基因功能研究中有着广泛的应用，对其机制和功能的研究比较透彻。miRNA 和piRNA 介导的内源性基因沉默作用作为一种重要的调节机制，在涡虫新陈代谢、生长发育、繁衍后代的过程中发挥重要作用。但目前对于这些小RNA的研究较少，对它们的作用机制和功能特性还不是很清楚。在未来的试验中，可以应用新的测序技术对不同再生阶段中的各类细胞和组织进行小RNA表达检测。同时，利用定点监测技术明确miRNA和piRNA的作用靶点，从而建立起涡虫小RNA 在干细胞维持及再生调节中的作用模型。另外，在生物体中还检测到许多其他非编码小RNA的存在。如snoRNAs和lncRNAs［42]，它们可调节哺乳动物的发育过程，猜测在涡虫中也具有相似的功能，可通过进一步的试验进行证实。

［1] Guo S, Kemphues KJ. Par-1, a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed［J] . Cell, 1995, 81（4）：611-620.

［2] Fire A, Xu S, Montgomery MK, et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA inCaenorhabditis elegans［J] . Nature, 1998, 391（6669）：806-811.

［3] 和琼姬, 燕飞, 陈剑平. RNA干扰机制及其主要蛋白因子研究进展［J] . 浙江农业学报, 2011, 23（2）：415-420.

［4] Alvarado AS, Newmark PA. Double-stranded RNA specifically disrupts gene expression during planarian regeneration［J] . Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 96（9）：5049-5054.

［5] Reddien PW, Oviedo NJ, Jennings JR, et al . SMEDWI-2 is a PIWI-like protein that regulates planarian stem cells［J] . Science, 2005,310（5752）：1327-1330.

［6] Chang CI, Kim HA, Dua P, et al. Structural diversity repertoire of gene silencing small interfering RNAs［J] . Nucleic Acid Therapeutics, 2011, 21（3）：125-131.

［7] 宋雪梅, 燕飞, 杜立新. RNA沉默诱导复合物中的生物大分子及其装配［J] . 遗传, 2006, 28（6）：761-766.

［8] 马丽, 张春庆. RNA干扰机制及应用研究进展［J] . 北方园艺,2012（10）：191-193.

［9] Newmark PA, Alvarado AS. Not your father’s planarian：A classic model enters the era of functional genomics［J] . Genetics, 2002, 3：210-219.

［10] Newmark PA, Reddien PW, Cebria F, et al. Ingestion of bacterially expressed double-stranded RNA inhibits gene expression in planarians［J] . Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100（1）：11861-11865.

［11] Saló E, Abril JF, Adell T, et al. Planarian regeneration：achievements and future directions after 20 years of research［J] . International Journal of Developmental Biology, 2009, 53（8-10）：1317-1327.

［12] Reddien PW, Bermange AL, Murfitt KJ, et al. Identification of genes needed for regeneration, stem cell function, and tissue homeostasis by systematic gene perturbation in planaria［J] . Developmental Cell, 2005, 8（5）：635-649.

［13] Lares MR, Rossi JJ, Ouellet DL. RNAi and small interfering RNAs in human disease therapeutic applications［J] . Trends Biotechnol, 2010, 28（11）：570-579.

［14] Shibata N, Rouhana L, Agata K. Cellular and molecular dissection of pluripotent adult somatic stem cells in planarians［J] . Development, Growth & Differentiation, 2010, 52（1）：27-41.

［15] Palakodeti D, Smielewska M, Lu YC, et al. The PIWI proteins SMEDWI-2 and SMEDWI-3 are required for stem cell function and piRNA expression in planarians［J] . RNA, 2008, 14（6）：1174-1186.

［16] Salvetti A, Rossi L, Lena A, et al.DjPum, a homologue ofDrosophilaPumilio, is essential to planarian stem cell maintenance［J] .Development, 2005, 132（8）：1863-1874.

［17] Guo TX, Peters AH, Newmark PA. A Bruno-like gene is required for stem cell maintenancein planarians［J] . Developmental Cell,2006, 11（2）：159-169.

［18] Juliano CE, Swartz SZ, Wessel GM, et al. A conserved germline multipotency program［J] . Development, 2010, 137（24）：4113-4126.

［19] Aboobaker AA. Planarian stem cells：a simple paradigm for regeneration［J] . Cell, 2011, 21（5）：304-311.

［20] Cebrià F, Newmark PA. Morphogenesis defects are associated with abnormal nervous system regeneration followingroboARNAi in planarians［J] . Development, 2007, 134：833-837.

［21] Lapan SW, Reddien PW. Transcriptome analysis of the planarian eye identifiesovoas a specific regulator of eye regeneration［J] .Cell Reports, 2012, 2（2）：294-307.

［22] Cebrià F, Kobayashi C, Nakazawa M, et al. FGFR-related genenoudarakerestricts brain tissues to the head region of planarians［J] .Nature, 2002, 419（6970）：620-624.

［23] Kobayashi C, Saito Y, Ogawa K, et al. Wnt signaling is required for antero-posterior patterning of the planarian brain［J] .Developmental Biology, 2007, 306（2）：714-724.

［24] Iglesias M, Almuedo-Castillo M, Aboobaker AA, et al. Early planarian brain regeneration is independent of blastema polarity mediated by the Wnt/β-catenin pathway［J] . Developmental Biology, 2011, 358（1）：68-78.

［25] Okamura K, Hagen JW, Duan H, et al. The mirtron pathway generates microRNA-class regulatory RNAs inDrosophila［J] .Cell, 2007, 130（1）：89-100.

［26] 张超, 庞全海. siRNA与miRNA在生物体基因调控中沉默机制的比较［J] . 中国生物化学与分子生物学报, 2012, 28（5）：393-398.

［27] Ender C, Krek A, Beitzinger M, et al. A human snoRNA with micro-RNA-like functions［J] . Molecular Cell, 2008, 32（4）：519-528.

［28] Newman MA, Thomson JM, Hammond SM. Lin-28 interaction with the let-7 precursor loop mediates regulated microRNA processing［J] . RNA, 2008, 14（8）：1539-1549.

［29] González-Estévez C, Arseni V, Thambyrajah RS. Diverse miRNA spatial expression patterns suggest important roles in homeostasis and regeneration in planarians［J] . International Journal of Developmental Biology, 2009, 53（4）：493-505.

［30] Rouhana L, Shibata N, Nishimura O, et al. Different requirements for conserved post-transcriptional regulators in planarian regeneration and stem cell maintenance［J] . Developmental Biology, 2010,341（2）：429-443.

［31] Li YQ, Zeng A, Han XS, et al. Argonaute-2 regulates the proliferation of adult stem cells in planarian［J] . Cell Research, 2011, 21（12）：1750-1754.

［32] Resch AM, Palakodeti D. Small RNA pathways inSchmidtea mediterranea［J] . International Journal of Developmental Biology,2012, 56（1-3）：67-74.

［33] Lu YC, Smielewska M, Palakodeti D, et al. Deep sequencing identifies new and regulated microRNAs in Schmidtea mediterranea［J] . RNA, 2009, 15（8）：1483-1491.

［34] Friedlǎnder MR, Adamidi C, Han T, et al. High-resolution profiling and discovery of planarian small RNAs［J] . Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106（28）：11546-11551.

［35] Thatcher EJ, Patton JG. Small RNAs have a big impact on regeneration［J] . RNA Biology, 2010, 7（3）：333-338.

［36] Malone CD, Brennecke J, Dus M, et al. Specialized piRNA pathways act in germline and somatic tissues of theDrosophila ovary［J] .Cell, 2009, 137（3）：522-535.

［37] Saito K, Siomi MC. Small RNA-mediated quiescence of transposable elements in animals［J] . Developmental Cell, 2010, 19（5）：687-697.

［38] Kibanov MV, Gvozdev VA, Olenina LV. Germ granules in spermatogenesis ofDrosophila：Evidences of contribution to the piRNA silencing［J] . Communicative & Integrative Biology, 2012, 5（2）：130-133.

［39] 张燕, 樊伯珍, 童晓文. piRNA在生殖系统中的功能研究进展［J] . 临床医学工程, 2010, 17（1）：143-145.

［40] VaginVV, SigovaA, Li C, et al. A distinct small RNA path way silences selfish genetic elements in the germline［J] . Science, 2006,313（5785）：320-324.

［41] Brennecke J, Aravin AA, Stark A, et al. Discrete small RNA-generating loci as master regulators of transposon activity inDrosophila［J] . Cell, 2007, 128（6）：1089-1103.

［42] Piao HL, Ma L. Non-coding RNAs as regulators of mammary development and breast cancer［J] . J Mammary Gland Biol Neoplasia,2012, 17（1）：33-42.