钙网蛋白免疫调节的分子机制研究

吴薇 刘朝奇

（三峡大学分子研究所，宜昌 443002）

钙网蛋白（Calreticulin，CRT）是一种在结构和功能上高度保守的钙结合蛋白，主要存在于内质网（endoplasmic reticulum，ER）［1]。大量研究发现，钙网蛋白具有多种功能，参与抗原提呈、分子伴侣、抑制血管生成及细胞黏附等生物学作用。因此，与多种疾病的发生发展有一定的相关性。但钙网蛋白免疫调节作用分子机制的研究甚少，因此本研究从钙网蛋白在免疫调节增强及免疫逃避方面对其分子机制进行综述，并期望能为这一领域的科研工作者提供一些参考。

1 CRT的免疫增强活性

1.1 CRT与吞噬作用

机体对凋亡细胞的清除是正常的基本的生理功能，这个过程对于维持机体的内环境稳定具有重要意义。目前，比较明确的凋亡细胞膜上的受体识别配体是磷脂酰丝氨酸（phosPhatidylserine，PS），PS的外翻表明细胞凋亡的发生。

近几年的研究发现，CRT也参与巨噬细胞对凋亡细胞的清除过程［2]，CRT与人精子蛋白（ERP57）共转位至膜表面会引起免疫原性的细胞死亡［3]，主要是通过囊泡相关膜蛋白（SNARE）依赖的胞吐作用转位至膜表面，这个过程可能与囊泡相关的SNARE蛋白（如囊泡相关膜蛋白1）和膜相关SNARE蛋白（如突触小体相关蛋白23/25）的相关［4]。

凋亡细胞表面CRT将会促进吞噬细胞的识别及吞噬作用，用siRNA技术将CRT基因沉默后会抑制吞噬细胞对凋亡细胞的吞噬作用［5]。诱导内质网应激反应的发生将会活化丝氨酸-苏氨酸激酶蛋白激酶样内质网激酶（protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）信号路线，主要表现为Ca2+离子的外流伴随着PERK980位苏氨酸的磷酸化，后者会导致真核起始转录相关因子2a（eIF2α）的磷酸化（51位苏氨酸），接着进入凋亡前期并伴一些凋亡相关因子活化，如半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-8（caspase 8），bcl-2相关蛋白X（bcl-2-associated protein X，Bax）［6，7]。以上研究均突出了CRT在吞噬作用中的重要性。

在用药物诱导CRT的膜转位时，蒽环类相比较其他细胞毒性制剂如奥沙利铂、顺铂，可以诱导免疫原性的肿瘤细胞死亡，即蒽环类药物可以引起细胞死亡并刺激机体产生抗肿瘤免疫反应而增强治疗效果，主要机制是活化PERK依赖的eIF2α磷酸化信号途径引发内质网腔的钙网蛋白膜转位至细胞表面［8]。PERK，caspase-8或者SNAREs的基因敲除对蒽环类诱导的细胞凋亡没有影响，但破坏了凋亡细胞的免疫原性，加入外源性的钙网蛋白可恢复其免疫原性［6]。

1.2 抗原提呈

主要组织相容性复合体（Major histocompatibility complex，MHC）在抗原提呈过程中发挥主要作用。一些研究发现［9]，CRT 具有广泛的连接蛋白质以及内质网腔内特定序列糖基化多肽的能力，抗原多肽会被TAP联合gp96、CRT或PDI 转运至内质网腔，而CRT 能与 MHC-I类分子A1区天冬酰胺连接的多聚糖结合，在 MHC-I 分子的折叠和组装过程中起作用［10]。MHC-I 类分子/抗原复合物由 CRT、TAP、tapasin，以及 MHC-I 类分子重链 β-2 微球蛋白（β-2m）共同组成，其中，CRT 发挥相关运载体功能，它利用抗原加工相关转运子（TAP-1，TAP-2）将多肽转运到内质网并组装到新生 MHC-I 类分子上，进而实现抗原提呈功能［11]。

应用基因敲除 CRT的K42 细胞的研究发现，CRTP区能抑制MHC-I类分子的表达，还能正常结合β2微球蛋白，但运载抗原肽的能力下降，外源性表达CRT 恢复该细胞抗原肽运载能力［12]。用从小鼠肿瘤细胞中分离的抗原肽/CRT 复合物免疫小鼠，观察到小鼠脾细胞活化，产生了特异性CD8 T细胞及有效的抗同种肿瘤免疫应答，单独使用CRT或抗原肽免疫小鼠未能诱导特异性免疫反应［13]。抗原肽正确的组装到MHC-I 类分子重链 β2微球蛋白（β2m）对于MHC-I类分子的功能和结构的稳定性很重要。

1.3 CRT在细胞表面的结合配体及其信号转导

蒽环类药物诱导钙网蛋白、热休克蛋白70和90快速膜转位至细胞表面，在处理12 h后高迁移率族蛋白B1（HMGB1）释放，使未成熟树突状细胞与免疫原性肿瘤细胞的相互作用，在对肿瘤细胞的摄取增多的同时也促进树突状细胞的成熟。被杀伤的肿瘤细胞负载到树突状细胞上能有效地刺激产生肿瘤特异性的γ干扰素，从而刺激T细胞的增值，减少调节性T细胞的产生［14]。

细胞表面相关CRT蛋白在缺少跨膜区时并没有一个明显的信号调节机制，或者细胞表面的CRT是以糖基化和GPI结合形式存在的［15]。迄今为止，除了LRP1/CD91，并没有其他的信号受体被证明能通过从外源性增加细胞表面CRT来介导细胞外信号。在测定不同的CRT功能时（如在体内伤口愈合试验中通过外源性的增加CRT蛋白可以明显的诱导细胞的迁移和增殖）是否依赖LRP1信号通路或者发现其他穿膜细胞表面结合配体。有研究发现，在没有LRP1的情况下CRT参与细胞表面的信号转导，可能是CRT可以通过细胞表面的碳水化合物类分子的募集来发出信号，包括蛋白聚糖类的糖苷键通过它的凝集素样结合而活化［16]。

与TSP1相似，在人外周血单核细胞的表面的多功能信号免疫调节细胞表面蛋白CD69分子与CRT的N端片段可能调节包括黏附在内的一些功能［17]。细胞表面的CRT通过自身发出信号的可能性不太大，但也并不能排除这种可能性［18]。然而，鉴于CRT具有多功能活性，很有可能是非信号蛋白的结合或者聚集，这种结合和聚集的机制是通过结合或者修饰其他细胞表面的跨膜分子来调节信号。

Holoshitz［19]研究也指出细胞表面钙网蛋白可以作为风湿性关节炎共享表位的信号转导受体。钙网蛋白上的共享表位结合位点位于其P区第217-223氨基酸残基，在和树突状细胞相互作用后，共同表位活化有效免疫调节系统。在能高表达细胞表面钙网蛋白的CD8阳性树突状细胞中，共同表位能抑制耐受性酶吲哚胺2，3二氧化酶并伴随着调节性T细胞分化的合成抑制；在CD8阴性的树突状细胞中，共享表位配体会增加IL-6和IL-23的分泌，并且能刺激Th17的产生，Th17细胞是与自身免疫相关的T细胞亚型。钙网蛋白是通过与共享表位结合来活化Th17细胞分化信号，所以在风湿性关节炎中细胞表面钙网蛋白可能是一种致病原。

2 CRT与免疫逃避

寄生虫在感染宿主其分泌物扮演着各种角色，包括感染的建立、结合免疫相关因子保护寄生虫避免宿主免疫系统攻击及组织渗透等，其中之一便是CRT。在多种寄生虫感染，如捻转胃虫、克鲁斯锥虫中都发现有CRT的身影。随着研究的进一步深入，其作用也慢慢为众多的研究者所知。

寄生虫感染宿主主要有两大策略，一是抗凝血作用；二是结合某些免疫相关因子来起到保护并且避免宿主免疫系统攻击的作用。在寄生虫感染时，作为一种抗感染免疫机制，宿主的红细胞会向寄生虫及其分泌物存在的部位聚集而发挥包裹作用。然而细胞的移动及黏附是钙依赖的，所以寄生虫会通过分泌CRT来扰乱血细胞对自身的包裹作用［20]。研究显示，寄生虫在分泌的CRT同时还会与宿主体内的补体结合蛋白C1q和C反应蛋白（CRP）结合抑制经典补体活化途径，因为CRP和C1q的结合将会活化经典途径，CRT不仅和C1q结合，同时还结合CRP起到了双重抑制作用［21]。在人源钙网蛋白研究中，除了已鉴定的补体蛋白C1q结合位点，在H的N区还存在着两个结合位点，虽然具体的机制还不是很清楚，但这种具有多个补体蛋白C1q结合位点与宿主寄生虫相互作用是有密切联系的［22]。

3 结语

近年来，随着钙网蛋白免疫调节研究的深入，对于阐明多种疾病的发生发展及相关治疗措施将会有巨大的推进作用。我们及其他研究团队都发现细胞膜上的CRT具有促进巨噬细胞吞噬活性，因此期望通过CRT基因与其他肿瘤靶向基因，如与肿瘤细胞膜上PD-L1结合的PD-1嵌合，构建获得融合蛋白达到靶向免疫治疗的目的。这种方式是借助机体自身的免疫力而非传统药物治疗，尤其是可以避免肿瘤治疗中放化疗所带来的各种副作用。但是目前大部分关于CRT免疫治疗的研究都停留在细胞、动物水平上，离临床治疗应用还有一段距离。如在人体运用的安全性问题；获得的融合蛋白纯度；以及大规模生产的运输和保存等问题。

目前，应在保证这种基因治疗临床运用的安全性的大前提下，尽可能更多地了解CRT免疫调节的机制，以及和其他基因构建获得的融合蛋白与机体相互作用的方式。随着研究的深入，CRT作为一种免疫治疗方式的前景将会更加广阔。

［1] Rizvi SM, Del Cid N, Lybarger L, Raghavan M. Distinct functions for the glycans of tapasin and heavy chains in the assembly of MHC class I molecules［J] . J Immunol, 2011, 186（4）：2309-2320.

［2] Gardai SJ, McPhillips KA, Frasch SC, et al. Cell-surface calreticulin initiates clearance of viable or apoptotic cells through transactivation of LRP on the phagocyte ［J] . Cell, 2005, 123：321-334.

［3] Jeffery E, Peters LR, Raghavan M. The polypeptide binding conformation of Calreticulin facilitates its cell-surface expression under conditions of endoplasmic reticulum stress［J] . J Biol Chem,2011, 286（4）：2402-2415.

［4] Martins I, Kepp O, Schlemmer F, et al. Restoration of the immunogenicity of cisplatin-induced cancer cell death by endoplasmic reticulum stress［J] . Oncogene, 2011, 30（10）：1147-1158.

［5] Gold LI, Eggleton P, Sweetwyne MT, et al. Calreticulin：non-endoplasmic reticulum functions in physiology and disease［J] . FASEB J,2010, 24（3）：665-683.

［6] Panaretakis T, Kepp O, Brockmeier U, et al. Mechanisms of preapoptotic calreticulin exposure in immunogenic cell death ［J] .EMBO J, 2009, 28：578-590.

［7] 张峻岭, 李卫泊, 谢绍建, 等. 米托蒽醌通过诱导钙网蛋白的表达抑制黑素瘤的生长［J] . 中国肿瘤生物治疗杂志, 2010, 17（1）19-24.

［8] Fucikova J, Kralikova P, Fialova A, et al. Human tumor cells killed by anthracyclines induce a tumor-specific immune response ［J] .Cancer Res, 2011, 71（14）：4821-4833.

［9] Kropp LE, Garg M, Binder RJ. Ovalbumin-derived precursor peptides are transferred sequentially from gp96 and calreticulin to MHC class I in the endoplasmic reticulum.［J] . J Immunol, 2010,184（10）：5619-5627.

［10] Smita N, Pamela AW, Duane AM, et al. Calreticulin displays in vivo peptide-binding activity and can elicit CTL responses against bound peptides［J] . Cell, 2005, 123（2）：321-34.

［11] Liu C, Fu H, Flutter B, et al. Suppression of MHC class I surface expression by calreticulin’s P-domain in acalreticulin deficient cell line［J] . Biochimica et Biophysica Acta, 2010, 1803：544-552.

［12] Pawaria S, Binder RJ. CD91-dependent programming of T-helper cell responses following heat shock protein immunization ［J] . Nat Commun, 2011, 2：521.

［13] Pawaria S, Messmer MN, Zhou YJ, et al. A role for the heat shock protein-CD91 axis in the initiation of immune responses to tumors［J] . Immunol Res, 2011, 50（2-3）：255-260.

［14] Yan Q, Murphy-Ullrich JE, Song Y. Structural insight into the role of thrombospondin-1 binding to calreticulin in calreticulin-induced focal adhesion disassembly ［J] . Biochemistry, 2010, 49（17）：3685-3694.

［15] Yan Q, Murphy-Ullrich JE, Song Y. Molecular and structural insight into the role of key residues of thrombospondin-1 and calreticulin in thrombospondin-1-calreticulin binding［J] . Biochemistry, 2011,50（4）：566-573.

［16] Pallero MA, Elzie CA, Chen J, et al. Thrombospondin 1 binding to calreticulin-LRP1 signals resistance to anoikis［J] . FASEB J,2008, 22：3968-3979.

［17] Vance BA, Harley PH, Backlund PS, et al. Human CD69 associates with an N-terminal fragment of calreticulin at the cell surface［J] .Arch Biochem Biophys, 2005, 438：11-20.

［18] Zhu Y, Zhang W, Veerapen N, et al. Calreticulin controls the rate of assembly of CD1d molecules in the endoplasmic reticulum ［J] . J Biol Chem, 2010, 49：38283 -38292.

［19] Holoshitz J, De Almeida DE, Ling S. A role for calreticulin in the pathogenesis of rheumatoid arthritis ［J] . Ann N Y Acad Sci, 2010,1209：91-98.

［20] Oladiran A, Belosevic M. Trypanosoma carassii hsp70 increases expression of in flammatory cytokines and chemokines in macrophages of the goldfish（Carassius auratusL.）［J] . Dev Comp Immunol, 2009, 33：1128-1136.

［21] Suchitra S, Anbu KA, Rathore DK, et al.Haemonchus contortuscalreticulin binds to C-reactive protein of its host, a novel survival strategy of the parasite［J] . Parasite Immunol, 2008, 30：371-374.

［22] Hewitson JP, Grainger JR, Maizels RM. Helminth immunoregulation：the role of parasite secreted proteins in modulating host immunity［J] . Mol Biochem Parasitol, 2009, 167（1）：1-11.