土壤杆菌ATCC31749合成可德胶的研究进展

余小琴 吴毅歆 何月秋 毛自朝

（云南农业大学农学与生物技术学院，昆明 650201）

可德胶（Curdlan）是一种由D-葡萄糖以β-1，3-糖苷键线性连接而成的中性多糖［1]。可德胶溶液在加热冷却后可以形成不同性质的胶体：加热60℃可以形成低固胶，加热到80℃可以形成高固胶［2]。因其独特的凝胶特性被广泛应用于农业、建筑及化工行业等多个领域。如在食品、化妆品等加工过程作为添加剂，其抗HIV、抗肿瘤、提高免疫力活性等特性使其具有广阔的医用前景［3-5]。目前全球可德胶产品约有50亿美元的市场份额，并预计以每年10%左右的需求速度增长。

可德胶可由细菌、真菌和植物等生物体合成，商用可德胶主要由农杆菌（Agrobacteriumspecies）及其衍生菌株发酵产生。土壤杆菌 ATCC31749（Agrobacteriumsp.ATCC31749）是一种革兰氏阴性细菌，菌体形态呈杆状，是可德胶发酵生产及研究的优良模式菌株［6]。土壤杆菌 ATCC31749的可德胶代谢是一个复杂的体系，外界环境对其基因的转录和蛋白质的表达有直接影响。大量试验表明，微生物利用糖质原料发酵时明显受到培养基中氮源条件的影响，土壤杆菌ATCC31749必须在氮源耗尽的条件下才能合成可德胶，而氮素充足时只进行的是正常的葡萄糖代谢途径［7，8]。但土壤杆菌 ATCC31749 的生长期与产胶期是非偶联的，因此可以采用两阶段发酵的方法提高产量。即第一步在正常氮源条件下增殖生长，提高菌体浓度；第二步在氮源限制条件下促使可德胶的合成［9]。研究人员还发现控制pH［10]，搅拌速率影响的氧溶解速率［11]，添加尿嘧啶［12]，使用多聚磷酸盐［13]等对可德胶合成有显著影响。本研究总结前人的研究结果，结合ATCC31749的基因组信息及蛋白组分析数据试图阐述可德胶生物合成途径及调控机理，并据此探讨可德胶发酵工艺优化和发酵菌株改良的可能途径。

1 基于土壤杆菌ATCC31749基因组信息对可德胶合成途径的分析

目前多个农杆菌菌株（包含ATCC31749）的基因组的测序已基本完成。2001年根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciensstr.）C58序列信息和相关注释的发表为土壤杆菌ATCC31749的基因信息研究提供了重要参考［14]。2011年，土壤杆菌ATCC31749基因组信息正式发表［15]，经blast分析，土壤杆菌ATCC31749与根癌农杆菌C58序列相似度达到95%。在可德胶合成途径的研究方面，Stasinopoulos等［16]通过转座子插入失活及功能互补分析，在土壤杆菌ATCC31749的基因组中定位了2个可德胶合成的基因座位，其中位置I是可德胶合成操纵子，含有crdA、crdS和crdC3个基因，位置II编码一个潜在调控可德胶合成的蛋白crdR；2003年，Karnezis等［17]研究确定了crdS基因编码可德胶合成酶的催化亚基，是可德胶合成的关键基因，利用crdS蛋白及纤维素合成酶作内参进行同源聚类分析，作出了Fulvimarina pelagiHTCC2506，Agrobacteriumsp. ATCC31749，Agrobacterium tumefaciens（strain C58/ATCC33970），Rhizobium leguminosarumbv.viciae USDA 2370，Agrobacterium tumefaciens5A，Agrobacteriumsp.（strain H13-3）的系统发育树，显示可德胶合成酶在土壤菌属关系较近，且与C58菌株具100%的同源性（图1）。

可德胶的合成需要低氮、低pH的环境因素诱导，也需要三羧酸（TCA）循环提供物质和能量，在可德胶合成期，TCA下游代谢受到抑制，脂多糖和脂蛋白合成减少，而UDPG与UDP之间转化增强，并消耗大量ATP，需要大量O2参与电子传递链来提供能量［18]。通过序列blast比对和蛋白组学分析，在C58中证实功能的关键基因可在ATCC31749中定位，如表1所示。表1中所示前两部分基因为ATCC31749可德胶代谢基本途径各酶的对应基因，其中第一部分基因编码逆境条件下催化可德胶合成各步骤的酶或因子，在可德胶合成期，其蛋白表达上调；第二部分基因编码正常条件下糖类、脂类、蛋白质循环代谢的各酶，在可德胶合成期，其蛋白表达下降［10]；第三部分为可德胶合成的调控基因；第四部分为电子传递链中的关键基因。目前表中所示的基因已在ATCC31749中找到精确的核酸和蛋白序列［19]，ATP等能量供应是影响可德胶产量的关键因素，其电子传递链能量代谢情况值得深入研究。ATCC31749与C58的基因组相似度极高（表1），而目前C58尚未有可德胶合成的报道，其原因或是C58缺少低氮等逆境条件下的诱导，或是其合成与运输基因调控网络中关键元件的缺失等，尚需进一步研究。

2 可德胶合成信号转导及其调控途径分析

2.1 氮信号转导途径

细菌的氮素调控经典途径是NtrB-NtrC双组件调控系统，菌体可通过胞内信号分子α-酮戊二酸（2OG）和谷氨酰胺（Gln）含量的比值变化来感知外界环境中氮源的丰缺程度。当胞内2OG 含量充足时，表明外界环境中氮源受到限制，组氨酸激酶 NtrB 催化应答调控蛋白 NtrC磷酸化，使 NtrC 处于活化状态，从而激活相关启动子和基因的转录，提高氮源利用相关酶的表达量，并且影响可德胶和其他多糖的合成，同时谷氨酰胺合成酶（GS）在腺苷转移酶（ATase）的作用下脱酰苷而处于活化状态，催化谷氨酸合成谷氨酸酰胺，进而在谷氨酸合成酶的作用下，催化α-酮戊二酸（2OG）与谷氨酰胺合成2分子谷氨酸，并尽可能有效地从外界吸收氮源，形成铵态氮后，转化为有机氮（主要是氨基酸和核苷酸）而快速适应氮源限制环境；相反，当胞内 Gln 含量充足时，表明外界环境氮源充足，NtrB调节磷酸酶活性使 NtrC 脱磷酸化而处于失活状态，关闭氮源代谢相关酶编码基因的转录和表达，此时菌体中GS被酰苷化而失活［20]。ATCC31749中NtrB-NtrC系统对氮源的反应已在基因和蛋白质水平得到了验证，由蛋白双向电泳结果表明有40种蛋白在NtrC突变体中不能表达，但是葡萄糖磷酸变位酶的活性在NtrC突变株中活性持续增长，在此条件下，此酶应是维持菌株正常生长的代偿性增长；对于NtrB 突变体，在氮源限制时NtrC应急反应不能进行［21]。Kim等［22]发现创伤弧菌（Vibrio vulnificus）胞外多糖的合成（包括CPS和EPS），受低氮条件下诱导，并受转录因子NtrC与σ因子（rpoN或其他）的调控，但Ruffing 等［23]

发现，RpoN（σ因子）敲出体中可德胶合成的增加30%，预示磷酸化的ntrC可能直接作为可德胶合成相关基因的活化转录因子，而RpoN的突变降低了RpoN对活性NtrC竞争结合，增强了可德胶合成代谢途径基因的转录活化。

表1 可德胶合成相关基因在土壤杆菌ATCC31749中定位情况

2.2 第二信使C-di-GMP对可德胶合成的作用

环二鸟甘酸（c-di-GMP）是1987年在研究木醋杆菌（Acetobacter xylinum）中纤维素合成调控的过程发现的，这种低分子量、高稳定的核苷酸信号分子使木醋杆菌纤维素产量提高200倍［24]。进一步研究表明，c-di-GMP是一种普遍存在的调控革兰氏阴性细菌生物膜合成的第二信使，通常含有GGDEF保守结构的合成酶（DGC）和含有EAL或HD-GYP保守结构蛋白的降解酶（腺苷二磷酸酶）来控制其在细胞内的合成和分解［25]。ATCC31749基因组含有31个含有GGDEF保守结构域的潜在鸟苷酸环化酶（DGC）和十几个含EAL或HD-GYP保守结构域的磷酸二脂酶（PDE）基因，表明ATCC31749菌株含有正常的c-di-GMP及信号传导系统。Ruffing等通过转录组分析发现，在限制氮源的培养条件下，有3个GGDEF保守结构域的基因表达增高2倍以上，将这3个基因敲出后，其中一个基因（AGRO_3967）的敲出，相比对照，可德胶合成降低了1倍。我在ATCC31749菌株中表达来源于大肠杆菌，能合成c-di-GMP的鸟苷酸环化酶（DGC）yddV基因和降解c-di-GMP磷酸二脂酶（PDE）yhjH，结果发现yddV和yhjH的表达改变了ATCC31749菌株中c-di-GMP的含量；在对pBQyddV/ATCC31749，pBQyhjH/ATCC31749，pBQ/ATCC31749（对照）3菌株进行可德胶的发酵培养发现，经120 h的发酵培养后pBQyddV/ATCC31749可德胶含量最高，pBQyhjH/ATCC31749几乎检测不到可德胶的合成，而对照pBQ/ATCC31749的含量低于pBQyddV/ATCC31749菌株（未发表数据），而初步揭示了在ATCC31749中可德胶的合成是受第二信使环鸟苷二磷酸（c-di-GMP）正调控。

C-di-GMP通过与效应蛋白受体（如fleQ，pelD，vpsR和vpsT）或被调控基因的非编码的特异序列形成的特殊二级结构（如核糖核酸分子开关，riboswtich）相接合而诱发基因转录、蛋白质翻译及翻译后修饰的信号网络传导过程，最终诱发与细菌运动、致病性、生物膜（包括胞外多糖）合成相关的生理代谢变化［26-28]。利用ATCC31749基因组信息进行blast分析：pelD未发现同源基因；FleQ，vpsR均与ATCC31749中低氮信号感应与传递的转录因子NtrC具55%的同源性；而VpsT则与其群体效应（quorum sensing）的转录因子LuxR 基因高度同源。Nesper等［29]报道了一个人工合成能从蛋白组中捕获c-di-GMP结合蛋白的分子（cdG-CC），该分子具有3个功能基团，用其进行c-di-GMP结合蛋白的分离及质谱测定是目前研究ATCC41749中c-di-GMP调控可德胶合成信号传递，特别是c-di-GMP受体分子的有效手段之一。

2.3 多聚磷酸盐、酸钙复合体、严紧反应相关的信号途径

能量的供应是可德胶合成的重要限制因子，一种潜在的能量源就是包括多个高能磷酸键的多聚磷酸盐［30]，在细胞内多聚磷酸盐在酸钙复合体中积累，其水平受到胞外多磷酸酯酶（PPX）活性的影响。多聚磷酸盐除了作为一种高能键的储备物外，它的积累也是一种严紧应答反应。细胞内作严紧反应信号，鸟苷五磷酸盐（pppGpp）和鸟苷四磷酸盐（ppGpp）［简称（p）ppGpp] 的积累能抑制胞外多磷酸酯酶活性外，还能直接影响许多基因的转录和翻译［31]。严紧反应信号（p）ppGpp的合成受氨基酸饥饿的诱导，在限制氮素时，氨基酸合成降低或停滞，而导致酮酸的积累进而降低胞内的pH值，pH为5.5时是可德胶合成的最佳条件，比其正常生长的pH（7.0）要低很多。在此过程中rrpP基因（编码一种膜相关的质子变位焦磷酸酶）可控制质子在胞液和酸钙复合体间的转运从而调节pH，它在可德胶合成期比菌体生长期表达下调了7倍；在可德胶合成过程中，转录组分析及敲出试验表明严紧控制信号基因relA/spoT系统决定着能否产生可德胶，而不仅仅是只调控其产量高低［23]。研究还发现，在该菌的培养基中加入三羧酸循环的代谢中间物（如柠檬酸，苹果酸等）可刺激多糖合成［32]，这与我们的前期研究在低氮、低pH条件的培养基中加入柠檬酸能增强野生型ATCC31749可德胶的产率（结果未发表）相符合。柠檬酸在此反应中除作为三羧酸循环的重要中间产物，还起到调节环境pH等作用。因此多聚磷酸盐积累、酸钙复合体形成导致的pH变化及细胞严紧反应因子的变化等相互交织，决定着可德胶的合成及产量。

2.4 crdR的调控作用

crdR是可德胶合成的潜在调控基因［16]，目前其对可德胶合成的调控机理的研究还较少，试验表明crdR的敲除使ATCC31749菌株丧失了可德胶多糖的合成能力［33]。我们在ATCC31749中表达crdR，相对于对照，可德胶合成增加35%，半定量PCR初步分析发现crdR表达后，无论在细胞增殖期还是在可德胶的合成期，ATCC31749菌株crdS均呈上调表达的趋势（未发表数据）。克隆后测序分析发现，crdR与苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti，Strain 1021）转录因子 phrR 高度同源，并且苜蓿中华根瘤菌中转录因子phrR的表达在pH<6.2的条件下增强了5倍［34]，类比预示ATCC31749菌株中，酸性条件刺激可德胶的合成可能受控于crdR的表达，目前推测crdR与pH降低所引起的信号感应与转导有很大关系。我们对可德胶多糖生物合成代谢网络的关键基因编码的蛋白crdA，crdS，crdC和crdR中均存在一些潜在的c-di-GMP结合的位点，推测c-di-GMP在ATCC31749菌株中，可能在转录水平上首先与crdR等转录因子相结合而诱导了包括crdA，crdS和crdC等合成相关基因的表达，且c-di-GMP进一步与crdA，crdS和crdC相结合，激活关键合成酶系统，但具体的调控可德胶的合成机制有待进一步的阐述。

3 展望

综合以上分析，就可徳胶发酵合成的整个代谢过程而言，氮源限制、酸性环境、溶氧量及搅拌速度等都密切影响着可徳胶的合成。根据测序的土壤杆菌ATCC31749基因组信息初步确定了可徳胶的合成途径和主要的调控基因及调控机理，但其信号转导网络有待更多的研究和相关试验的证实。文献中有一些有趣的问题引起了我们的注意：在可徳胶合成过程中，能量比底物的限制更具影响力，研究者对发酵过程中UTP、ATP、ADP、AMP、NAD+、NADH和UDPG等进行监测发现，即使UDPG的量很高，但ATP水平不高时可徳胶合成仍然很有限［10]，蛋白组学结果表明在可徳胶合成量高时，ATP合成酶和UTP合成酶表达都有较大增长［23]。虽然现在公认的可徳胶合成是以UDPG为单糖载体，但ATP在其中所起的作用是不可否认的，ATP可作为能量物质也可能是单糖的结合载体。在可徳胶合成后转运途径中，PssAG可能参与了运输过程［35]，但可德胶从胞内运输到胞外的通道结构和调控机制也是将来研究的热点。

为了提高大规模发酵生产中可德胶的效率，菌株选育与优化是关键，虽然传统的诱变选育方法获得良好的效果，但在基因组信息已知的前提下，代谢工程手段改造是获得高产菌株是另一条重要途径。提高热凝胶合成过程中葡萄糖转化为可德胶的代谢流，增强菌体细胞呼吸链的整体效率以增强ATP的生成能力，并结合普通的诱变与适应驯化应该是未来菌株优化的首选方法。如通过表达Vhb基因增强在可德胶合成过程中细胞内的氧分压［36]，表达c-di-GMP合成酶基因（如AGRO_3967）增加胞内c-di-GMP含量，表达pH调控相关的蛋白crdR等（见前述）；通过ATCC31749基因组信息敲除如rpoN、部分c-di-GMP降解酶、多聚磷酸水解酶ppX1等基因将是未来代谢工程改造和优化菌株的首选方法；增强该菌株廉价碳源利用如纤维素、半纤维素利用能力的酶类的表达，从而降低发酵成本；并且从工艺上改进发酵设备，优化规模，提高分离纯化水平等解决可德胶生产过程的限制因子，提高可德胶的产量和质量。

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