RNA干扰及其在植物研究中的应用

王婷婷 王丹丹 Rahman Laibi Chelab 康丹游腾飞 眭安平 杨星勇

（1. 西南大学生命科学学院，重庆 400715；2.西南大学图书馆，重庆 400715）

RNA干扰（RNA interference，RNAi）在20世纪90年代被发现，是指内源性或外源性双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）导致细胞内同源mRNA发生特异性降解的过程［1]。RNA干扰现象普遍存在于真菌、果蝇、线虫、涡虫、植物及动物等大多数真核生物中，它可以阻断生物体内特定基因的表达，从而使细胞表现出特定基因缺失的表型，是一种在进化上高度保守的调节机制［2]。RNA干扰现象自被发现后，迅速发展成为一种强大的基因沉默工具，是当今生物学研究的一大热点，现在对RNA干扰的作用机理和特点的研究已取得很大进展。同时，对RNA干扰在植物研究上的应用也取得丰硕成果，植物体可以利用RNA干扰来抵御病毒或者外来核酸的侵入，从而保护机体免受病毒等侵害。此外，利用RNA干扰技术可以进行植物基因功能分析、基因表达和调控、作物品种改良和抗病虫害等。随着研究的不断深入，RNA干扰将在植物学研究领域发挥越来越重要的作用。

1 RNAi的作用机制

自从Fire等［3]发现双链RNA可以诱导生物体内同源靶标基因降解并将其命名为RNAi后，人们对RNAi进行了大量的研究，对RNAi的作用机制也在不断的探索当中，目前认为RNAi可以分为以下3个阶段：起始阶段、效应阶段和扩增阶段。

1.1 起始阶段

dsRNA是诱导细胞产生RNAi的关键成分，转基因、病毒感染及转座子活动等都能使细胞产生dsRNA。这些dsRNA在内切核酸酶，即Dicer酶的作用下加工裂解形成21-25nt的dsRNA片段，这些片段被称为小干扰RNA（short interfering RNAs，siRNA）。Bernstein等［4]通过对果蝇进行试验发现，RNAi过程中降解dsRNA的关键酶是CG4792，并将其命名为Dicer。Dicer是RNaseⅢ家族中的成员，它含有解旋酶结构域、PAZ结构域、RNaseⅢ催化区域和dsRNA结合结构域，在其他生物体内也发现了Dicer类似物。siRNA分子两条单链的3'端是羟基且具有2个突出的非配对碱基，5'端的磷酸基团会被一种特殊的激酶保护起来，这一结构是siRNA进入效应阶段所必须的。

1.2 效应阶段

起始阶段产生的siRNA进一步与多种蛋白成分结合，形成RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC），RISC的组成包括Argonaute家族蛋白、内切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RNA链搜索活性等，其第一个亚单位为siRNA［5]。紧接着，在RNA解旋酶的作用下，RISC中的siRNA解链和正义链被去除，反义链与靶mRNA分子互补结合并切割靶mRNA分子，从而阻断基因的表达。

1.3 扩增阶段

以mRNA为模板，siRNA为引物，在RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-directed RNA polymerase，RdRp）作用下，通过类似PCR的扩增作用再次形成dsRNA，dsRNA又被Dicer切割产生次级siRNA，次级siRNA又进入下轮循环，这样就产生了一种级联放大的效应［6]。因此，只需要极少的dsRNA，就可以产生强大的沉默效应。Chen等［7]发现在植物中，22 nt的siRNA对次级siRNA的形成起着关键作用。

2 植物RNAi作用的特点

2.1 具有高度序列特异性

Brummelkamp等［8]利用RNAi沉默人的MCF-7基因时发现，siRNA上一对碱基突变会抑制沉默效应，植物RNAi也存在这种高度的序列特异性，RNAi这种特性使得dsRNA只能特异地降解与之序列同源的mRNA，而不能对其他基因产生影响，这样就保证了对目的基因的精确沉默。

2.2 沉默基因的高效性

由于RNAi存在级联放大效应，RNAi途径一旦被启动，就可以高效沉默基因的表达，因此每个细胞只需少量的dsRNA就可以使目标基因沉默［9]。向细胞内导入针对多个基因的dsRNA，还可以一次性沉默多个基因。Kubo等［10]经过研究后发现，与棕榈酸结合的27 nt dsRNAs（C16-dsRNAs）具有很高的膜通透性，而且具有很高的基因沉默效率。

2.3 RNAi的可扩散性和遗传性

目前已有大量的资料证实，在植物RNAi过程中siRNA充当沉默信号［11]。沉默信号可以在植物体内传递，局部传递通过胞间连丝实现，长距离传递通过韧皮部进行；通过嫁接沉默信号可以在砧木和接穗之间双向传递，而且沉默信号可以在不同的物种个体间传递。如植物与取食植物的昆虫之间，沉默效应甚至可以传递给后代［12]。

2.4 沉默信号的高稳定性

siRNA的3'端有突出的TT或UU碱基，因此化学性质很稳定，无须像反义核苷酸那样进行广泛的化学修饰以提高半衰期［1]。

3 RNAi在植物中的应用

RNAi具有特异性、高效性、作用迅速和高稳定性等特点，利用RNAi技术的这些特点可以进行植物基因功能分析，并对某些基因的表达进行调控，也可以对植物进行改良。另外，RNAi在植物抗病虫、抗逆性等方面也有重要的作用。总之，RNA干扰作为一种反向遗传学的研究方法，为植物基因组学的发展提供了一个很好的技术平台。

3.1 植物基因功能分析

人类已经进入后基因组时代，基因组学的重心已由结构基因组学转向功能基因组学，RNAi技术以其高度专一性和作用迅速等特点，为研究功能基因组学提供了一个高效、便捷的平台。利用RNAi研究植物基因功能已取得了较大进展，Gong等［13]在研究SOS2家族的蛋白激酶基因PKS时发现，将PKS18导入拟南芥中后，转基因植株对ABA敏感，当用RNAi将PKS18沉默后，植株对ABA不敏感。由此证明，PKS18与ABA信号转导有关。Nishihara等［14]从烟草的花瓣上分离克隆了查耳酮异构酶（CHI）基因，并利用RNA干扰对其进行研究，结果发现，该基因可影响烟草花瓣颜色和类黄酮的积累。Xu等［15]利用RNA干扰技术研究水稻OsPIN1发现，在转基因水稻中不定根的生长和发育明显受到抑制，因此研究者认为0sPIN1基因在水稻不定根的发生和发育上有重要作用。PIN2是在茄科植物中发现的丝氨酸蛋白酶抑制剂，Sin等［16]利用RNA干扰技术使PIN2基因的表达受阻，结果种子的形成受到影响。通过细胞学和分子生物学分析表明，该基因表达降低使得种子的内表皮发育不正常，最终造成种子败育。由此证明，PIN2基因与内种皮的发育有关。通过对基因家族中高度保守的序列构建RNAi载体，可以对整个基因家族进行功能分析，已有科学家利用此方法对基因家族功能进行分析。

3.2 植物改良方面的应用

在植物改良方面，RNAi显示了极大的优势，与传统的育种方式相比，它不仅可以缩短育种周期，而且可以特定的改变农产品的某种品质，从而满足人们的特定需求。番茄是类胡萝卜素和黄酮类化合物的主要食物来源，Davuluri等［17]利用RNAi技术，特异地抑制了番茄内源性光形态建成调节基因DET1的表达，相应的类胡萝卜素和黄酮类化合物的含量提高，这表明通过对调控基因进行沉默，可以同时影响几个拥有不同合成途径的植物营养素的产量，为改变农作物营养价值提供了一个很好的方法。利用生物学方法降低烟草中的有害成分，一直是人们关注的问题。研究发现，N亚硝基去甲烟碱（NNN）能导致试验动物发生癌变，NNN是去甲烟碱亚硝化形成的，而去甲烟碱是尼古丁在脱甲基酶作用下形成的次级生物碱。因此，通过降低去甲烟碱的含量即可起到降低有害成分NNN的作用。Lewis等［18]利用RNAi技术沉默了烟草中的脱甲基酶基因发现，转基因烟草中的去甲烟碱的含量与对照相比降低了6倍，NNN的含量也明显降低。青蒿素是从艾草中分离出来的一种抗疟疾药物，但它在艾草中的含量很低。Zhang等［19]研究了艾草中的一种鲨烯合酶SQS，该酶是固醇合成途径的关键酶，而固醇合成通路影响青蒿素的合成，他们利用发夹RNA介导的RNAi技术沉默SQS的表达，在得到的阳性转基因植株中青蒿素含量显著增加。这个结果表明，RNAi在改变植物代谢物含量方面有重要作用。

3.3 植物抗病毒研究中的应用

在植物中，RNAi具有抵抗病毒入侵的作用，是植物抵抗病毒感染的防御机制之一。体外设计合成与病毒同源的dsRNA，然后将其导入植物体，当用相同的病毒感染植物时，植物会通过RNAi机制对病毒转录的mRNA进行切割降解，从而阻止病毒的复制扩张，进而保护植物体不受病毒危害。Andika等［20]利用RNAi使烟草获得了抗甜菜坏死黄叶病毒的抗性，而且发现烟草叶片对病毒的抗性强于根部。Shimizu等［21]利用RNAi沉默了水稻矮缩病毒的一个病毒原质基质蛋白基因Pns12，结果转基因水稻获得了对该病毒抗性，他们认为利用RNAi沉默病毒复制相关蛋白，可以高效的控制农作物病毒感染。Zhang等［22]以苜蓿花叶病毒、豆荚斑点病毒和大豆花叶病毒的保守序列为模板，分别构建了大约150 bp的短反向重复序列，将这3种结构组装进表达载体后导入大豆植株，最后获得3株转基因植株，且其对3种病毒都具有抗性。Zhou等［23]利用RNAi研究水稻条纹病毒（RSV），构建了针对RSV外壳蛋白和疾病特异性蛋白的两种沉默表达载体，然后将它们导入水稻品种Suyunuo and Guanglingxiangjing，结果转基因水稻对RSV的抗性都增加。这些研究都证明，利用RNAi可以有效的抵抗病毒对植物的伤害。

3.4 植物抗虫害方面的应用

在植物抗虫方面，利用RNAi也取得了很多研究进展。Mao等［24]在棉花中表达了针对P450基因CYP6AE14的双链RNA，棉铃虫食用了此种转基因植物后，CYP6AE14基因的表达显著降低，对棉酚的耐受性大大减弱，棉铃虫生长变得缓慢。Sindhu等［25]向拟南芥中导入了4个甜菜孢囊线虫生命周期相关基因的dsRNA，线虫在取食RNAi植物后，其体内4个基因的表达都受到抑制，并且转基因植株中成熟雌性线虫的数量明显减少。Zha等［26]利用RNAi研究了褐飞虱的中肠基因，他们将3种中肠基因的dsRNA导入水稻植株，然后喂食褐飞虱，结果发现，褐飞虱中这3种基因的表达都受到抑制，但是褐飞虱并没有出现致命性死亡。Ibrahim等［27]将酪氨酸磷酸酶（TP）和线粒体应激70蛋白前体（MSP）的RNAi结构导入大豆根部，结果发现由根结线虫引起的虫瘿减弱，同时根结线虫与对照组相比个体也明显变小。Matsunaga等［28]将南方根结线虫POS-1基因的dsRNA接种到番茄的根部，接着用根结线虫侵染根部发现，根结线虫的孵化率与对照组相比明显降低。以上研究表明，在植物中表达与昆虫同源的双链RNA，可以触发取食昆虫体内发生RNA干扰，进而影响昆虫生长甚至杀死昆虫。而且利用RNAi技术防治害虫具有很高的特异性，不会对其他有益昆虫产生影响。

3.5 植物抗逆性中的应用

RNA干扰技术应用于植物抗逆性方面的研究比较少。Kaplan等［29]研究发现，将拟南芥在4℃冷冻下处理，植株中的β-淀粉酶（BMY8）被诱导，且植株中积累了大量麦芽糖，而BMY8-RNAi株系经过4℃冷冻胁迫后，植株中麦芽糖的积累量很少，通过测定发现BMY8-RNAi株系的叶绿素荧光率Fv/Fm与野生型相比降低了。该研究表明，在冻胁迫作用下增加植物体内麦芽糖含量有助于保护电子传递链上的蛋白质 。Marzin等［30]利用瞬时诱导基因沉默（TIGS）的方法，筛选大麦干旱胁迫应答相关基因，结果发现，在干旱胁迫下有4个基因的表达量下降，而对照组则没有任何变化，4个表达量下降的基因分别编码大麦干旱应答因子HvDRF1、脱水蛋白6、胚胎发育后期丰富蛋白HVA1和液泡膜Na /H逆向转运蛋白HvHNX1。Manavalan等［31]利用RNAi技术阻断了水稻的鲨稀合酶基因，当在暗箱里干旱处理一段时间后发现，转基因植株比野生型植株更晚表现出萎蔫症状，在其生殖期对其进行干旱处理，转基因植株失水情况较轻，该研究为水稻抗旱提供了策略。利用RNAi筛选与抗逆性相关的基因，从而改造植株使其具有抗旱、抗温度胁迫等抗性，将有利于植株在逆境中生存。

4 展望

RNAi介导的基因沉默是植物在基因调控水平上的自我保护机制，是一种高效、特异性强的基因阻断技术，在植物基因功能研究、作物品种改良、病虫害防治等方面发挥着重要作用。近年来RNAi发展迅速，为功能基因组学研究提供了有力工具，现已成为生物学研究的热点之一。虽然RNAi的研究已经取得了很大的成果，但关于RNAi机制仍有很多问题没有解决，如需要多少分子的siRNA才能敲除一个基因，哪些蛋白成分参与了siRNA在生物体内的扩散，RISC是如何精确识别正反两条链；靶标mRNA的哪些性质会影响RNAi的稳定性等等。同时，RNAi的安全性也需进一步验证。这些都阻碍了RNAi技术的发展，也影响了其在植物中的应用。不过，随着植物基因组序列的不断开发，以及人们对RNAi技术的不断深入研究，该技术也将在植物各领域的研究中发挥越来越重要的作用。

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