对乙酰基偶氮羧光度法测定大豆中可溶性蛋白

冯爱青，胡秋娈，侯晓慧

（1.洛阳师范学院生命科学系，河南 洛阳 471022；2.洛阳师范学院化学化工学院，河南 洛阳 471022）

2006 年在上海召开的“中国大豆食品产业圆桌峰会议”提出了发展中国大豆产业，实施“双蛋白（大豆+牛奶）工程”振兴计划[1]，人们对大豆蛋白的研究与开发倍加重视。大豆是最丰富、最优质的植物蛋白资源，其水溶性蛋白质可以被人体直接吸收利用，因此对大豆水溶性蛋白的研究及测定具有重要意义[2-3]。

国内对大豆水溶性蛋白质的测定主要采用经典的凯氏定氮法，此法操作繁杂，而且测定的是样品中的含氮量，除了蛋白质组成中的氮外，还包括非蛋白质组成中的其他有机或无机态氮[4-5]。如何科学准确地测定蛋白质含量，是现代食品检测研究中最活跃的领域之一，也是解决食品安全方面所面临的重要问题。

蛋白质测定的光谱分析方法有直接紫外光谱法、分光光度法、荧光光度法、共振瑞利散射光谱法等。其中分光光度法具有操作简便、成本低、灵敏度高、重现性好等优点[6]。研究发现，在pH2.90 的Britton-Robinson缓冲介质中，紫红色的有机试剂对乙酰基偶氮羧能与蛋白质形成蓝色复合物，λmax 669 nm，该波长下的表观摩尔吸光系数为3.09×105L/（mol·cm），蛋白质在10 μg/mL～100 μg/mL（BSA）范围内遵循比尔定律，以此建立的蛋白质测定新方法，线性范围宽，灵敏度高。用于大豆水溶性蛋白的测定，操作简便，重现性好，基本无干扰，取得满意结果。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

UV-3010 型紫外可见分光光度计：日本日立公司；pHS-3C 精密pH 计：上海雷磁仪器厂；722 型光栅分光光度计：上海欣茂仪器有限公司；10 mL 具塞比色管。

对乙酰基偶氮羧：上海长科试剂研究所，2.0×10-4mol/L；牛血清白蛋白、人血清白蛋白：BSA、HSA，北京百泰生化技术公司；卵蛋白（OVA）：上海伯奥生物科技公司；溶菌酶（LYS）：上海丽珠东风生物技术有限公司；酪蛋白（CAS）：上海华硕精细化学品有限公司；蛋白质浓度均为1 mg/mL；Britton--Robinson（B-R）缓冲溶液；十二烷基硫酸钠（SDS），0.1%；TritonX-100（TX-100），1%；溴代十六烷基吡啶（CPB），0.1%；聚乙醇辛基苯基醚（OP），2%。所用试剂均为分析纯，试验用水为二次去离子水。

1.2 方法

于10 mL 具塞比色管中依次加入1.0 mLB-R 缓冲溶液，2.0 mL 对乙酰基偶氮羧溶液，0.5 mLBSA 标准溶液，1.0 mLTX-100 溶液，水稀释至刻度，摇匀，以相应试剂为参比，用1 cm 比色皿扫描吸收光谱或于669 nm 测定溶液的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 吸收光谱

吸收光谱如图1。

图1 吸收光谱图（pH2.90）Fig.1 Absorption spectra（pH2.90）

在pH2.90 的B-R 缓冲溶液中，对乙酰基偶氮羧的λmax 为577 nm（a），加入BSA 后，溶液颜色由透明紫红色变为蓝色，在669 nm 处产生最大吸收（b），表明有新的物质生成。从对乙酰基偶氮羧和BSA 在酸性条件下的结构可知，二者主要靠静电引力形成了复合物，使λmax 红移约92 nm。在一定浓度范围内，BSA 浓度与吸光度值呈良好的线性关系，实验选择669 nm 作为测定波长。

2.2 缓冲溶液及用量选择

在不同pH 的缓冲溶液中，测定复合物的吸光度。结果表明：在VB-R=0.5 mL～2.0 mL 的缓冲溶液中，体系稳定，吸光度值最大。实验用1.0 mL 的B-R 缓冲溶液，控制反应体系的pH 为2.90。

2.3 试剂用量选择

固定蛋白质的用量，改变对乙酰基偶氮羧的用量，随着对乙酰基偶氮羧用量的增加，吸光度在不断的增加，VR=1.8 mL～2.2 mL 时吸光度基本保持不变，实验取对乙酰基偶氮羧的用量为2.0 mL，CR/CBSA=54∶1。

2.4 反应时间及稳定性

对乙酰基偶氮羧与BSA 反应迅速，室温下（15 ℃～20 ℃）瞬间达到稳定，1 h 内吸光度保持不变。试验了30 ℃和35 ℃（水浴）的反应时间及稳定性，结果表明温度影响不明显。

2.5 离子强度的影响

加入NaCl 测试了体系的离子强度，结果表明，NaCl 的浓度为0.01 mol/L，体系的吸光度提高7.6%，随着NaCl 加入量增加，吸光度又逐渐降低，当NaCl 浓度达到0.1 mol/L 吸光度提高7.6%，随着NaCl 加入量增加，吸光度又逐渐降低，当NaCl 浓度达到0.1 mol/L时，体系吸光度降低50%。离子强度的影响进一步表明对乙酰基偶氮羧与BSA 之间主要是通过静电作用结合的。

2.6 表面活性剂和有机溶剂的影响

分别试验了阳离子表面活性剂（CPB），阴离子表面活性剂（SDS），中性表面活性剂（OP、TrittonX-100），无水乙醇对体系吸光度的影响，结果表明：加入CPB、SDS，体系吸光度迅速减小，当CPB 为0.005%时，吸光度减少99.3%，SDS 为0.001%，吸光度减少27.8%；OP 对吸光度影响不大；TrittonX-100 和无水乙醇，使吸光度增加，其中TrittonX-100 加入0.1%，吸光度提高23%。实验选用0.1%的TrittonX-100。

2.7 精密度

取10 份浓度均为7.35×10-6mol/L 的BSA 溶液，按照试验方法进行平行测定，吸光度的平均值0.404，RSD0.46%。

2.8 标准曲线

在试验条件下，研究了对乙酰基偶氮羧与牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白（HSA）、卵蛋白（OVA）、溶菌酶（LYS）、酪蛋白（CAS）的响应情况，绘制相应的标准曲线列于表1。

从表1 中结果可知，灵敏度高，线性范围宽是本方法的突出优点，一向响应较低的卵蛋白也有较高的灵敏度。还具有BSA 和HSA 响应接近、酪蛋白灵敏度更高的特点。

表1 蛋白质的工作曲线Table 1 Calibration curve of proteins

2.9 干扰离子的影响

用本方法对有可能干扰的一些物质，按大豆中各组分物质的实际含量进行测定[7-8]，结果列于表2。

表2 干扰物质的影响Table 2 Interfering of substances

结果表明，大豆中存在的无机离子，产生的误差均在±5%以内，基本不干扰。

3 样品测定

样品制备：准确称取干豆粉（黄豆，黑豆）1 g 于60 ℃烘干，粉碎，过100 目筛，加温水10 mL 浸泡30 min，于50 ℃下搅拌50 min，于4 000 r/min 下离心分离。取5 mL上层提取液，加2 mL 四氯化碳，搅拌，离心分离，取上层液1 mL，稀释50 倍备用。

样品测定：按照试验方法，测其结果及回收率见表3。

结果表明，对乙酰基偶氮羧光度法测定豆类中可溶性蛋白含量为：黄豆0.36 mg/mL，黑豆0.38 mg/mL，回收率符合生化分析要求。

表3 样品中蛋白质测定结果（n=3）Table 3 Assay results of proteins of sample（n=3）

4 结论

在酸性条件下，有机试剂对乙酰基偶氮羧与无色的大豆蛋白及TrittonX-100 形成三元反应体系，生成蓝色多元可溶性复合物，该复合物在波长669 nm 处的表观摩尔吸光系数为3.09×105L/（mol·cm），蛋白质在10 μg/mL～100 μg/mL（BSA）范围内遵循比尔定律，以此建立了选择性及灵敏度较高的蛋白质测定新方法，用于大豆中可溶蛋白质的测定，操作简便，克服了经典方法中测定非蛋白氮的不足，为准确测定大豆水溶性蛋白质提供了一种科学安全的原理和方法。

[1]伊宗伦,王婧,涂顺明,等.“双蛋白工程”与中华民族的强盛[J].中国食品学报,2007,7(1)：1-5

[2]刘志胜,李里特,辰巳英三.大豆蛋白营养品质和生理功能研究进展[J].大豆科学,2000,19(3)：263-268

[3]程莉君,石雪萍,姚惠源.大豆加工利用研究进展[J].大豆科学,2007,26(5)：775-780

[4]盛成乐.关于凯氏定氮法测定蛋白质的几个问题[J].中国酿造,2002(2)：43-44

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[7]马立安,江涛.大豆的药用价值[J].食品研究与开发,2000,21(2)：43-44

[8]韩立德,盖钧镒,张文明.大豆营养成分研究现状[J].种子,2003(5)：57-59