苜蓿皂苷的抑菌活性和抗氧化特性的研究

李波，孙天颖，于鑫洋

（1.齐齐哈尔大学生命科学与农林学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2.齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006）

紫花苜蓿是一种优质且高产的多年生豆科牧草，是我国推广应用的主要牧草，其品质好、产量高、适口性好、易于家畜消化，故有“牧草之王”的美誉。除了有很高的营养价值，它还有许多药用价值，可镇痛、保肝、抗过敏、抗病毒、抗肿瘤、抗风湿、抗细菌、抗动脉硬化，还用于治疗糖尿病、高血脂、雌激素失调等症[1]。目前，苜蓿皂苷提取工艺的研究还处于实验室阶段，对其生理活性的研究才刚刚起步。本实验对苜蓿总皂苷进行提取，并对其抑菌效果和抗氧化的能力进行深入研究，为苜蓿的开发和利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与药品

肇东苜蓿叶：取自黑龙江省畜牧研究所；菌种为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、面包酵母、根霉、黄曲霉、绿霉：由莫继先老师（齐齐哈尔大学）提供；石油醚、正丁醇、香草醛、高氯酸、水杨酸、过氧化氢、DPPH、邻苯三酚、Tris、菲咯嗪等，试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 苜蓿皂苷的提取

苜蓿粉→浸泡→最佳超声条件提取（时间30 min，温度20°C，功率80 W）→减压蒸馏→萃取3 次（石油醚）→萃取3 次（正丁醇）→减压蒸馏→香草醛高氯酸比色法测定吸光值→由齐墩果酸标准曲线y=0.007 4x-0.244 5[2]得皂苷含量。

1.2.2 苜蓿皂苷对不同菌的抑制作用

将菌种活化后制含菌平板，用滤纸片法测定皂苷对不同菌的抑菌效果，对有抑菌效果的菌种测定其最低抑菌浓度。

1.2.3 清除羟基自由基活性

用水杨酸捕获法[3]测定产生的2，3-二羟基苯甲酸在510 nm 处的吸收值变化来确定清除率。

1.2.4 清除超氧自由基活性

用邻苯三酚自氧化法[4]测定产生的有色中间产物在325nm 处的吸收值变化，确定对该自由基的清除率。

1.2.5 清除DPPH 自由基活性

用捕获DPPH 自由基法[5]测定DPPH 醇溶液在517 nm 处的吸收值变化，确定皂苷的清除率。

1.2.6 螯合Fe2+能力

以菲咯嗪为显色剂[6]，测定其在562 nm 处的吸收值变化，确定皂苷对Fe2+的螯合能力。

2 结果与分析

2.1 苜蓿皂苷的抑菌作用

苜蓿皂苷的抑菌效果见表1。

表1 苜蓿皂苷的抑菌效果Table 1 Antibacterial effect of alfalfa saponins

表1 显示三种浓度的皂苷提取液对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌两种细菌有抑制作用，对其他五种真菌没有抑制作用。苜蓿皂苷对两种细菌的抑菌圈的大小，见表2。

表2 苜蓿皂苷对两种细菌的抑菌效果Table 2 The inhibition effects of alfalfa saponin on two kinds of bacteria

在测定抑菌圈大小时发现3 种不同浓度的皂苷提取液对细菌的抑制作用不同。利用SPSS17.0 统计分析：3 种浓度的皂苷溶液对枯草芽孢杆菌抑菌效果之间差异极显著（F=281.692，P<0.01）；对大肠杆菌抑制效果差异极显著（F=940.809，P<0.01）。两种细菌在同一皂苷浓度下，抑菌效果差异极显著。

两种细菌的最低抑菌浓度结果见表3。

表3 细菌的最低抑菌浓度Table 3 The minimum inhibitory concentration of bacteria

由表3 可知6 种不同浓度的皂苷提取液对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度分别为0.024 0 mg/mL和0.047 9 mg/mL。两者相比枯草芽孢杆菌对抑制浓度的要求更高。

2.2 苜蓿皂苷的抗氧化活性测定

苜蓿皂苷的抗氧化活性和抗氧化能力分别见表4和图1。

表4 苜蓿皂苷的抗氧化活性Table 4 The antioxidant activity of alfalfa saponins

图1 苜蓿皂苷的抗氧化能力Fig.1 Antioxidant of alfalfa saponins

图1 和表4 的分析显示，苜蓿皂苷对羟基、超氧、DPPH3 种自由基均有清除作用，对Fe2+有螯合作用。且抗氧化能力和皂苷浓度呈线性关系，即清除能力和螯合能力随着皂苷浓度的升高而增强。同一浓度的皂苷提取液对DPPH 自由基的清除作用最强。

3 结论

皂苷提取液对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌两种细菌有抑制作用，对酵母、黑曲霉、黄曲霉、根霉、绿霉五种真菌没有抑制作用。3 种不同浓度的皂苷提取液对细菌比对真菌的抑制作用更强。皂苷对大肠杆菌及枯草芽孢杆菌的最低抑制浓度分别为0.024 0 mg/mL 和0.047 9 mg/mL。

皂苷提取液对羟基、超氧、DPPH 三种自由基均有清除作用，对Fe2+有螯合作用。抗氧化能力与皂苷浓度之间呈现线性关系，即清除能力和螯合能力随着皂苷浓度的升高不断增强。且同一浓度的皂苷提取液对DPPH 自由基的清除作用最强。

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