微波辅助提取莲雾多糖

2013-07-12李粉玲蔡汉权洪仰纯

食品研究与开发 2013年1期

李粉玲，蔡汉权，洪仰纯

（广东韩山师范学院，广东潮州 521041）

20 世纪初，由于膜的化学功能、免疫物质的化学研究与发展以及新药物资源的寻找与研究等，发现糖类在生物体中的作用不仅是作为能量资源或结构材料，更重要的是广泛参与细胞识别、细胞生长、分化、代谢、胚胎发育、细胞癌变、病毒感染、免疫应答等生命现象中细胞的各种活动，具有多种多样的生物学功能，因此糖的研究开始逐步活跃起来。其中，一些分子量在几千以上，具有很强生物活性的活性多糖的研究受到日益重视，它们的生理活性、化学结构以及构效关系成为多糖研究的前沿阵地，是现代医学和食品功能化学共同关注的焦点。

多糖作为水果中的一类重要结构物质与功能物质，在各种水果中均大量存在。这些多糖不仅赋予果实一定的质构特性和感官品质，而且在果实病虫害防御等方面具有重要的作用，因此常常成为水果成熟度判定、贮藏加工、品质分析控制和病害防治研究中的一项重要指标。从2001 年来随着天然活性多糖研究的深入，大量的水果多糖资源不断被发掘利用，目前已报道的水果活性多糖种类达几十种，几乎涉及到所有常见水果种类[1]。

莲雾（Syzygium samarangense Merr.etPerry.），又名金山蒲桃、洋蒲桃、辈雾、琏雾、爪哇蒲桃、水蒲桃等，是桃金娘科蒲桃属热带常绿乔木果树，原产马来半岛及安达曼群岛，是著名的热带水果。莲雾的用途很广，莲雾树速生快长，周年常绿，树姿优美；花期长，花浓香，花形美丽；挂果期长，果实营养丰富，是营养全面的水果，被称为“水果皇帝”。同时在食疗上有清热、利尿、安神、润肺、止咳、除痰等功能，能辅助治疗咳嗽、痔疮、腹满、肠炎、痢疾、糖尿病等常见疾病[2]。文献中对莲雾的营养成分分析结果表明，莲雾多糖含量较高[3]。本实验将利用微波技术这一现代手段辅助提取莲雾多糖。

多糖的提取方法有碱提法、水提法、微波法、酶提法和超声波辅助提取法等。本试验采用的是微波辅助提取法，微波萃取技术即微波辅助萃取（Microwavessisted extraction，MAE），是用微波能加热与样品相接触的溶剂，将所需化合物从样品基体中分离，进入溶剂中的一个过程。微波提取技术具有快速、溶剂用量少、提取率高、成本低、质量好等优点[4-6]。

微波提取可用于大生产，其安全可靠，无污染，属于绿色工程，生产线组成简单，并可节省投资。十多年来，此项技术已广泛应用于食品、生物样品及环境样品的分析与提取。在多糖提取方面微波提取技术已应用于南瓜多糖、柑橘皮多糖、赤灵芝孢子多糖等的提取[7-10]。

微波萃取在用于某些生物材料的多糖提取中被证实可明显提高提取率。张海容[11]等人以香菇多糖为研究对象，采用单因素分组实验法对香菇多糖提取工艺（热水法和微波提取法）进行了初步的探讨，比较了时间，浸取温度，浸取次数，液固比等因素对多糖提取率的影响。其中传统热水提取法的最佳工艺条件为：液固比10，加热温度45 ℃，加热时间5 h，提取二次。微波法提取香菇多糖的最佳工艺条件：液固比10，功率40%，加热时间180 s，PH 值1。通过两种最佳工艺条件的结果比较可知，微波萃取法具有节能、省时、环保、操作便利且提取率高等优点。

国内微波能在农业和食品加工业中应用的技术水平与国外的有一定差距，但这并不妨碍它成为一条新的物料处理的有效途径，其发展前景十分广阔[12]。

用苯酚-硫酸法测定多糖含量，苯酚-硫酸法显色原理为糠醛衍生物与2-萘酚缩合生成有色物质，在490 nm 波长处有特征吸收，测定多糖含量。多糖在硫酸存在下先水解成果糖，再衍生成具有呋喃环结构的化合物——糠醛，甲基五碳糖生成的是5-甲基五碳糠醛，六碳糖生成的是5-羧甲基糠醛。测定吸光度时所用葡萄糖标准溶液与莲雾多糖都需现配现用才能保证结果的稳定性及准确性，每组需平行测定3 次。用分光光度法测定莲雾中多糖的含量，此方法简单，准确率高。且生成的颜色持久，用苯酚-硫酸法测定多糖含量时需注意苯酚浓度不宜太高，这样反应的稳定性不好且易产生操作误差。本实验采用5%浓度的苯酚，测定结果较为理想。同时保持较高的硫酸浓度对多糖含量测定非常重要，因此该呈色反应是以对多糖的水解和糠醛反应为基础的，硫酸浓度降低会影响两种反应的进行[13-14]。

1 实验材料、试剂与仪器

1.1 材料

莲雾（采自潮州市）

1.2 试剂

葡萄糖标准品，95%乙醇、苯酚、浓硫酸及其他试剂均为分析纯。

5.0%苯酚试剂的配制：称取苯酚100 g，加铝片0.1 g 和NaHCO30.05 g 蒸馏，收集182 ℃馏分。称取7.5 g，加水150 mL 溶解，置棕色瓶内放冰箱备用，得5.0%苯酚试剂。

葡萄糖标准溶液的配制：准确称取干燥至恒重的葡萄糖标准品0.1 g，加适量水溶解，转移至100 mL 容量瓶中，加蒸馏水至刻度摇匀，制得浓度为1 mg/mL 的葡萄糖溶液，再准确移取10 mL，用蒸馏水定容至100 mL，得0.1 mg/mL 的葡萄糖标准液。

1.3 仪器

移液管；吸量管；容量瓶；碘量瓶；离心管；试管。

FA2004N 电子天平722SP 可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；SHD-III 循环水式多用真空泵：保定高新区阳光科教仪器厂；101A-1 型电热鼓风干燥箱：上海实验仪器厂有限公司；冷藏冷冻箱：BCD-217YB Haier；组织捣碎机：金坛市医疗仪器厂；数显恒温水浴锅HH-8：常州华普达教学有限公司；KDM 型调温电热套：山东鄄城永兴仪器厂；800 型离心沉淀器：上海手术器械厂；ET-Q 型气浴恒温振荡器：常州荣冠实验分析仪器厂。

2 方法

2.1 莲雾多糖的提取工艺

2.1.1 莲雾的预处理

将莲雾洗净切碎，放在101A-1 型电热鼓风干燥箱以60℃左右烘烤，粉碎，过40 目筛，于试剂瓶中密封备用。

2.2 多糖含量的测定

苯酚-硫酸法。

葡萄糖标准曲线制作：分别吸取葡萄糖标准液（0.1 mg/mL）0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，加水稀释至1 mL，向各管中加入5%苯酚试剂1 mL，混匀。沿管壁加入浓硫酸5 mL，静置5 min，振摇，置沸水浴中加热15 min，立即转入冷水浴中冷却至室温。以蒸馏水为空白，在490 nm 波长处测定吸光度。以葡萄糖的含量为横坐标，吸光值为纵坐标制作标准曲线得直线回归方程

2.3 莲雾多糖含量测定

取莲雾多糖浸提液溶于适量蒸馏水中，转移到100 mL 容量瓶中，定容。精密吸取上述溶液1.0 mL，按“标准曲线制作”项下操作，测定吸光度，根据回归方程求出含量。

计算公式：

提取液多糖含量（mg）=c×V

式中：c 为标准曲线上查得的葡萄糖浓度，（mg/mL）；V 为莲雾多糖溶液稀释后的总体积，mL；W 为提取多糖时称取的莲雾重量，g。

3 结果与讨论

3.1 葡萄糖标准曲线的制作

按照2.2 操作所得数据（如表1）制作葡萄糖标准曲线。

表1 葡萄糖标准曲线制作Table 1 The production of glucose standard curve

以吸光度A 为纵坐标，葡萄糖的浓度（mg/mL）为横坐标，做葡萄糖标准曲线，见图1。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 glucose standard curve

3.2 莲雾多糖提取工艺流程

准确称取5.00 g 莲雾样品于索氏提取器中用石油醚（80 ℃）回流脱脂两次，1 h/次，每次60 mL。再用95 %乙醇回流提取两次，1 h/次，每次60 mL。除去单糖和低聚糖，将其烘干[15]。再进行称重，将其平均分成5 份，放入5 个碘量瓶中，按一定比例加入蒸馏水（料液比），在合适功率（微波功率）下微波浸提数秒（浸提时间），浸提结束后趁热减压抽滤，收集滤液。

相同条件下，再将滤渣洗入碘量瓶中二次浸提，浸提数次（浸提次数）后，合并滤液，加热浓缩至2 mL～3 mL（原料重∶浓缩液=1∶2）。

加入4 倍体积的95℅乙醇，充分搅拌，放入冰箱中静置2 h，在4 000 r/min 下，离心15 min。收集沉淀。沉淀物用无水乙醇洗涤，如此重复数次，直到乙醇接近无色，得到的沉淀即为粗多糖。

得到的粗多糖加50 mL 的蒸馏水使其重新溶解，加入Sevage 试剂[16-17]（正丁醇：氯仿=5∶1），振荡15 min，静置2 h，脱去蛋白，过滤，取其滤液，用蒸馏水溶解后定容100 mL 容量瓶中，利用苯酚-硫酸法测其吸光度A，根据回归方程可算出多糖的含量W。

原料的微波浸提时间、微波功率、料液比以及微波浸提次数对多糖的提取结果均有影响，据以上流程，在单因素试验的基础上，以多糖提取量为指标进行正交试验，确定微波萃取莲雾多糖的最佳条件。

以提取多糖的因素为横坐标，多糖含量（mg/g）为纵坐标做图分析比较。

3.3 单因素实验

3.3.1 微波浸提时间对莲雾多糖提取的影响

将5.0 g 回流烘干的莲雾粉末平均分成5 份于250 mL 碘量瓶中，按照料液比1∶40（g/mL）加入40 mL水，在微波功率60%（480 W）条件下分别浸提30、60、90、120、150 s，趁热过滤，苯酚-硫酸法测定多糖的提取量，结果见图2。

图2 莲雾多糖含量与微波浸提时间的关系Fig.2 Effects of microwave extraction time on the content of lotus fog polysaccharide

从图2 看出微波加热浸提120 s 时多糖提取量最大，浸提时间小于120 s 多糖提取不充分，浸提时间大于120 s，随着时间的延长，多糖提取量逐渐降低，可能与较高温度下加热浸提时间过长导致多糖降解有关。

3.3.2 微波浸提功率对莲雾多糖提取的影响

将5.0 g 回流烘干的莲雾粉末平均分成5 份于250 mL 碘量瓶中，加入40 mL 蒸馏水，分别在20 %、40 %、60%、80%、100%（100%功率为800 W）功率下加热浸提120 s，趁热过滤，苯酚-硫酸法测定多糖含量计算提取量，结果见图3。

图3 莲雾多糖含量与微波浸提功率的关系Fig.3 Effects of microwave power on the content of lotus fog polysaccharide

由图3 看出莲雾水溶性多糖的提取量先是随着微波功率的增加而增大，功率80%时多糖提取量最大。随着微波功率的加大，微波的热效应能够快速提升浸提液的温度，有利于待提取物质扩散到溶剂中，而且微波具有穿透特性使莲雾细胞破壁，使水更容易浸入，多糖有效成分容易浸出。但当微波功率大于80%后，多糖提取量率开始降低，可能由于微波萃取功率过高，浸提液较长时间处于高温条件下，对多糖会产生一定的降解作用。

3.3.3 料液比对莲雾多糖提取的影响

将5.0 g 回流烘干的莲雾粉末平均分成5 份于250 mL 碘量瓶中，按料液比1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100（g∶mL）加入相应体积的水，微波功率80%（640 W），加热浸提120 s，测定多糖提取量，结果见图4。

图4 莲雾多糖含量与料液比的关系Fig.4 Effects of solid-liquid ratio on the content of lotus fog polysaccharide

从图4 可知，当料液比为1∶40（g∶mL）时达到最高提取量，为此，选择料液比1∶40（g∶mL）为提取条件。

3.3.4 微波浸提次数对莲雾多糖提取量的影响

将3.0 g 回流烘干的莲雾粉末平均分成3 份于250 mL 碘量瓶中，根据上述试验所得最佳浸提条件：浸提时间120 s、微波功率80%，料液比1∶40（g∶mL）、研究多糖浸提次数对多糖提取量的影响，分别浸提一至三次，结果见图5。由图5 可看出二次浸提时样品液中多糖含量达到最大值，因此二次浸提为最佳的浸提次数。

图5 莲雾多糖含量与微波浸提次数的关系Fig.5 Effects of times on the content of lotus fog polysaccharide

3.4 正交试验设计

在微波浸提时间、微波功率、料液比以及微波浸提次数对莲雾多糖提取率影响单因素试验的基础上，进行L9（34）正交试验，试验设计及结果见表2、表3。

表2 正交试验因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal test

表3 L9（34）正交试验设计及试验结果Table 3 L9（34）Orthogonal experimental design and test results

表3 中极差值大小反映出影响莲雾多糖提取率的主次因素顺序为浸提次数＞微波功率＞料液比＞微波时间，经方差分析显示微波浸提次数和微波功率是显著影响因素。

4 结论

4.1 实验结果

本实验通过三水平四因素正交试验，确定了莲雾多糖的最佳提取条件，即为：微波浸提时间为120 s、微波功率80%（640 W）、料液比1∶40（g∶mL），浸提次数3 次。

由于该组合未出现在试验中，需要测定该条件下莲雾多糖的提取率，经测定，莲雾在该条件下的提取量达到12.64 mg/g，高于正交试验中出现的最高提取率，说明正交试验确定的最佳微波萃取条件是合理的。

4.2 前景展望

近几年来研究较多的是莲雾的组织和规模化生产以及分析莲雾的营养成分，目前对植物多糖的提取技术有较深入的研究，而对于提取果实多糖的研究，仍处于初始研究阶段，目前微波萃取技术的应用基本上还停留在实验室小样品的提取及分析，使用设备简陋，工业化微波提取器尚未见报道。而对于莲雾这种产量丰富，极易栽培，挂果期长的特点来说，一旦这些设备应用于大生产，必将对食品、香料业、传统中药制药业等相关行业带来巨大的革命，大大提高莲雾的利用价值，具有一定的开发意义。

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