加热与超高压对缢蛏蛋白质变性及酶解的影响

卢婷，刘金福，刘伟，李有起

（1.郑州大学生物工程系，河南郑州450001；2.天津农学院食品科学系，天津300384；3.天津市食品研究所有限公司，天津301609）

超高压技术（high pressure，HP）是一种主要的非热加工技术。与传统的热加工相比，超高压加工具有杀菌温度低，能更好的保持食品固有的营养成分、质构、色泽和新鲜度等特点。现在国内外对超高压加工产品的研究重点已经由抑菌、钝酶的作用向引起产品的理化性质变化的质构、化学、营养学、生物学等更深入的方向进行。缢蛏（Sinonovacula constricta lamarck），俗称蛏子[1]，它主要分布于西太平洋沿海的中国、日本和朝鲜，被称为四大养殖贝类之一[2]。缢蛏肉味鲜美，是高蛋白、低热量、低脂肪的健康海洋食品之一。现在市场上出售的主要是生鲜缢蛏或加工的蛏干，但缢蛏容易腐败，很难长途运输，所以严重限制了市场范围。通过比较热加工、超高压加工与未处理生鲜缢蛏的感官品质、蛋白变性程度及酶解效果等，为缢蛏的深加工提供借鉴。

1 材料与仪器

1.1 材料

缢蛏：天津市红旗农贸批发市场；中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶：天津市诺奥生物技术有限公司，经测酶活力分别为242 588、133 767、3 480 U/g；胃蛋白酶：四川省德阳市生化制品有限公司经测酶活力3 011 U/g。

1.2 设备

电热恒温水浴锅：天津市华北实验仪器有限公司；紫外分光光度计WFJ7200：尤尼柯（上海）仪器有限公司；电子天平JA 2003：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；酸度计：HANNA；凯氏定氮仪UDK 159 DKL：VELP SCIEWTIFICA；离心机Anke 7DL-5：上海安亭科学仪器厂；差示扫描量热仪（DSC）200F3：德国耐驰热分析仪器；核磁共振仪：上海纽迈电子科技有限公司；磁力搅拌器JB-3：上海雷磁新泾仪器有限公司；真空干燥箱DZF-6210：上海精宏实验设备有限公司；超高压设备：天津光辉有限公司提供。

2 方法

2.1 缢蛏处理方法

热加工：100 ℃下蒸煮5 min[3]。

超高压加工：500 MPa，20 ℃下保压15 min，在此反应条件下，具有较好的杀菌效果。该产品在4 ℃条件下保鲜效果很好，货架期为8 d～9 d[4]。

2.2 酶解工艺流程

2.3 测定方法

2.3.1 蛋白酶酶活力测定

SB/T 10317-1999《蛋白酶活力测定法》。

2.3.2 缢蛏水分的测定

GB/T 5009.3-2010《食品中水分的测定》。

2.3.3 缢蛏蛋白测定

微量凯氏定氮法[5]。

2.3.4 游离氨基态氮

甲醛滴定法[5-6]。

2.3.5 水解度的测定

水解度（DH）是衡量蛋白质水解程度的重要指标，指水解断裂的肽键数目占总肽键数目的百分比。水解断裂的肽键数可通过水解释放出的氨基态氮数目来测定，按照下面公式计算[6-7]。

2.3.6 持水性的核磁共振测定法

核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）是指具有固定磁矩的原子核，在恒定磁场与交变磁场的作用下，以磁电波形式吸收或释放能量，发生原子核的跃迁，同时产生核磁共振信号，即原子核与射频区电磁波发生能量交换的现象。根据分辨率差异可分为高低分辨率两种类型。低场核磁共振（Low field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）指磁场强度在0.5 T以下的核磁共振，检测样品的物理性质[8]。

2.3.7 蛋白质变性程度的DSC 测定

差示扫描量热法 （Differential Scanning Calorimetry，DSC）是在程序控制温度下，测量输给物质和参比物功率差与温度关系的一种技术。称取15 mg～30 mg 的经处理后的缢蛏匀浆放入样品池，密封后放入仪器中，以空气作为参比物，保护气为氮气，生物速率10 ℃/min，从30 ℃升温至90 ℃[9]。

3 结果与讨论

3.1 不同处理的缢蛏肉质持水性分析

采用核磁共振方法，实验参数如下：PulSeqType=2；SF1（MHz）=22；O1（kHz）=963.296 7；P90（us）=13.5；P180（us）=27.0；TD=160 040；SW（kHz）=200；D3（us）=75；TR（ms）=2 500；RG1=20；RG2=3；NS=4；EchoTime（us）=200.00；EchoCount=2 000；GA1（%）=0，对生鲜、加热、超高压蛏子进行核磁共振检测，图谱如图1 所示。

图1 不同处理方法缢蛏核磁共振弛豫时间分布Fig.1 NMR relaxation time distribution of Sinonovacula constricta lamarck by different treatment methods

肉制品水分的横向弛豫时间（T2）呈多指数衰减，一般T2可以分为T21（0 ms～10 ms）、T22（10 ms～100 ms）、T23（100 ms 以上），分别对应结合水、不易流动水、自由水[10]。肌原纤维蛋白质变性对肉制品具有重要的影响，利用低场核磁共振（Low field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）质子弛豫行为测定水分分布，可以判断蛋白质变性情况[11]。Bertram 研究发现，T21主要与存在机体中的蛋白质结构有关，T22与肌原纤维之间的空间水分有关[12]。蛋白质变性主要是导致聚集的β-折叠构象增加，天然的β-折叠和α-螺旋结构降低，从而导致T21分布变宽，对应面积增大。同时，蛋白质结构发生变化，导致结合于蛋白质上的结合水结合的松弛，当水分结合的越紧密松弛时间越短，故而随着蛋白质变性程度的加深，T2出峰的时间越来越靠后。

由图1 可以看出，生鲜缢蛏T21首峰峰起时间为0.657 933 ms，面积约为16.57；加热5 min 后缢蛏T21首峰峰起时间为1.149 76 ms，面积约为21.23；超高压后缢蛏T21首峰峰起时间为0.869 749 ms，面积约为17.26。加热缢蛏的峰面积＞超高压缢蛏的峰面积＞生鲜缢蛏的峰面积，且T2的出峰时间的先后顺序依次为：生鲜缢蛏、超高压缢蛏、加热缢蛏。无论是从T2的出峰时间还是T21的峰面积大小均可看出：加热处理使得缢蛏蛋白质变性程度大，对蛋白质结构影响更大。

3.2 不同处理的缢蛏蛋白质变性分析

差示扫描量热法（DSC）对研究天然聚合物的结构和热力学特征是一种非常有效的工具，近年来逐渐被食品界用来进行蛋白质变性和组织结构变化的研究[9]。不同处理得到的缢蛏匀浆DSC 扫描图谱如图2。

图2 不同处理方法的缢蛏DSC-温度曲线Fig.2 DSC-temperature curve of Sinonovacula constricta lamarck by different treatment methods

生鲜缢蛏DSC 图谱在35 ℃附近出现的为肌球蛋白峰，在70 ℃附近出现的为肌动蛋白峰。经过超高压处理缢蛏的两个峰趋于平缓，加热处理后的峰更加平缓。表明超高压和加热处理使维持蛋白质结构的氢键断裂，从而引起肌球蛋白和肌动蛋白发生不可逆的变性，加热处理变性更为明显。

3.3 产品成分及感官评价

加热、超高压处理后缢蛏的水分及蛋白含量与未处理生鲜缢蛏水分蛋白含量比较如表1 所示，在色泽、形态、风味及质地[13]四个方面进行感官评价，如表2 所示。

通过表1 可以看出超高压处理后缢蛏含水量高，加热处理使得缢蛏严重脱水。上述核磁共振分析的结果在感官评价中得到了同样的反映。对两种缢蛏成品进行感观评价发现，超高压处理的缢蛏肉质白色，蛋白质发生了一定的变性，但其形态变化不大，口感滑嫩；加热处理的缢蛏肉质较老韧。可见，对缢蛏进行超高压加工可以开发出口感独特的产品。

表1 缢蛏水分及蛋白含量Table1 WaterandproteincontentofSinonovaculaconstrictalamarck

表2 加热和超高压缢蛏的感官评价Table 2 Sensory evaluation of Heating and high pressure Sinonovacula constricta lamarck

3.4 不同处理的缢蛏蛋白质的酶水解及效果

利用正交实验，测定中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶分别酶解三种不同处理的缢蛏匀浆，测定酶解后的水解度，结果见表3、表4、表5和表6。

使用四种已知酶活力的不同蛋白酶对缢蛏进行酶解，均表现出生鲜缢蛏的水解度最大，500 MPa，15 min 超高压处理缢蛏蛋白的水解度高于100 ℃加热5 min 缢蛏的水解度的现象。查看资料发现，不同来源的动物蛋白变性后酶解效果不同，鸡肉和蛋类蛋白质经加热变性后，更容易酶解[14-15]，而对于鱼、贝等水产品情况恰好相反，加热蛋白质变性后，更不容易酶解[3]。本实验也得到类似结果：加热容易导致缢蛏蛋白质脱水和变性，对蛋白酶的酶解作用影响更大，比生鲜缢蛏蛋白的水解度明显降低。超高压处理也会引起缢蛏蛋白变性，但持水性较高，形态变化不大，与未处理的生鲜缢蛏接近，酶解相对容易些 由此可知，对缢蛏进行酶解加工生产蛋白肽等产品时，使用生鲜缢蛏为原料更容易获得水解液；生鲜缢蛏、超高压加工的缢蛏可能比热加工的产品更易于被人体消化吸收，有待于进一步深入研究。

表3 中性蛋白酶酶解水解度Table 3 Hydrolysis degree of bacillus protease

表4 木瓜蛋白酶酶解水解度Table 4 Hydrolysis degree of papain

表5 胰蛋白酶酶解水解度Table 5 Hydrolysis degree of trypsin

表6 胃蛋白酶酶酶解水解度Table 6 Hydrolysis degree of pepsin

4 结论

通过差示扫描量热仪（DSC）和核磁共振（NMR）的检测分析方法，对加热、超高压处理的缢蛏蛋白质变性程度进行分析，100 ℃加热处理5 min，缢蛏蛋白质变性程度要远高于超高压500 MPa，20 ℃，15 min 处理的产品。经感官评价，通过超高压法制得的缢蛏产品，色泽、形态完好，口感滑嫩独特，且可以杀菌、钝酶，延长产品的货架期[4]。超高压技术是对缢蛏进行深加工，开发新产品的重要途径。

不同蛋白酶的酶切位点不同，会导致水解度不同，同时蛋白质的变性程度和方式也会影响酶解效果。胰蛋白酶对缢蛏蛋白的水解效果最佳，而后依次为胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶。采用500 MPa，20 ℃，15 min 超高压处理、100 ℃加热处理5 min 和生鲜缢蛏原料比较，四种蛋白酶均对生鲜缢蛏蛋白质的水解度最高。

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