食物致敏蛋白研究进展

李阳，薛文通

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）

随着快速的城市化发展、消费者需求的日益变化以及国际食品贸易的增加，世界各地食品安全事件的发生呈现井喷状。目前影响食品安全的生物因素中，食物过敏问题已经尤为突出。据我国相关资料统计，约有6%的6岁以下儿童以及2%的成年人都会对食物产生过敏反应，而在美国每年约有三万起食物过敏病例急诊，因此过敏病症一直困扰大家[1]。过敏性较高可导致90%以上病例的八类食物为蛋、牛乳、豆、花生、坚果类、甲壳类动物、鱼类以及谷物[2]，其中引起这八大类食物致敏的因素大多是蛋白质类、或能结合到蛋白质上的化合物。虽然八大类高致敏食物是威胁人类健康的隐形杀手，但考虑到其本身的营养价值以及可观的经济效益，调查中国主要致敏食物品种、识别其致敏蛋白，研究致敏机理进而开发低致敏或抗过敏食品就具有重要的理论意义和现实意义。

1 食物致敏蛋白识别

1.1 植物性食物致敏蛋白

植物性食物蛋白中大豆，花生以及谷物等过敏原早已被大量实验所证实，具体可分为种子贮藏蛋白、结构蛋白和防御蛋白[3]。90年代，Ogawa等发现大豆主要过敏蛋白为Glym Bd30k，Glym Bd28k和β-7s伴大豆球蛋白[4]。2007年，刘晓毅通过PBS缓冲液提取蛋白、利用SDS-PAGE凝胶电泳、免疫印迹以及竞争性抑制试验得出非发酵性豆制品存在大量致敏蛋白，其中脂肪氧化酶和32.5 KDa致敏蛋白难被识别，β-7s伴大豆球蛋白存在非特异性吸附且是最主要的致敏蛋白[5]。

坚果类的过敏原以花生的研究较为充分。早在20年前，Sachs et al从花生原料中发现第一个致敏蛋白并命名为Peanut-I之后[6]，国际上目前已采用IgE检测的办法识别出了7种致敏蛋白Ara h1—Ara h7[7]，其中Ara hl和Ara h2为主要致敏原。尤丽丽采用热加工花生乳为原料与IgE特异性结合后得到分子量依次为31.3、29.5、23.8 kDa 三条性质稳定的区带[8]。

Matsuda等运用 HPLC、ELISA、SDS-PAGE及亲和层析分离纯化出大量存在于水稻胚乳中分子量为16、15.5、14 kDa的清蛋白，这3种蛋白是目前已知的水稻中最主要的过敏蛋白[9]。小麦过敏原表位多集中于分子量为 20、27、31、36、47 kDa 以及谷氨酰胺－谷氨酰胺－谷氨酰胺－脯氨酸－脯氨酸的（Gln－Gln－Gln－Pro－Pro）五肽结构[10]。实验得出油料作物黑白两种芝麻中质量为11 kDa的蛋白为主要变应原[11]。

1.2 动物性食物致敏蛋白

牛乳蛋白中，乳清蛋白质的β－乳球蛋白以及酪蛋白中的αs1－酪蛋白的过敏活性最高。鸡蛋致敏蛋白主要存在于蛋清中，公认的过敏成分为卵类粘蛋白、卵清蛋白、卵转铁蛋白和溶菌酶四种蛋白[12]。

动物性食物致敏蛋白中海产品的研究始于20世纪中叶，自从Aas纯化鉴定出鳕鱼过敏成分为小清蛋白后，国内外大量研究表明各种鱼类变应原均为小清蛋白[13]。无论是鲤鱼、鲭鱼、金枪鱼等常见家鱼还是马鲅、印度小公鱼、鲳鱼和卡瓦拉马鲛四种热带鱼，其致敏蛋白均为分子量为10 kDa～14 kDa，等电点为3.9～5.5的钙结合小清蛋白并且主要存在于鱼肉的肌浆蛋白部分[14]。

采用SDS－PAGE凝胶电泳、免疫印迹和酶联免疫吸附测定等方法对纯化甲壳类虾、蟹蛋白识别得到分子质量依次约为200、175、116、85和36 kDa的原肌球蛋白[15]。

软体类鱿鱼过敏蛋白是具有热稳定性的Tod p 1，38 kDa，鲍鱼则是约34 kDa的Hal d 1原肌球蛋白[16]。

1.3 食品添加剂

食品添加剂引起的过敏反应通常为非IgE介导的免疫反应，部分人群对防腐剂、色素、抗氧化剂发生如荨麻疹和血管性肿胀等过敏现象[17]。

1.4 转基因食品

很多转基因食品使用过敏性未知的微生物作为基因供体，来自非食品源的基因和新的基因结合体就能够在一些植物或动物受体中引发过敏反应，或者使已存在的过敏反应加剧[18]。

2 食物过敏蛋白致敏机理

变态反应按照发生机制习惯上被学者分为I－IV型，食物过敏属于I型即时性过敏。食品过敏的主要效应为IgE介导的免疫应答，包括致敏和发敏两个阶段。一定量的过敏原刺激易感个体产生特异性IgE抗体，IgE通过血循环分布全身，并与肥大细胞（MastceH，MC）、嗜碱性粒细胞（Basophil，Bas）膜表面特定的受体结合，从而使机体处于致敏状态。当再次接触含相同或相似过敏原成分的食品时，过敏原分子与IgE发生“桥联”，诱导细胞脱颗粒，释放组胺、白三烯、激肽和嗜酸性粒细胞趋化因子等一系列炎症介质而触发食物过敏症[19]。

2.1 食物抗原决定簇

任何食物仅有部分变应原诱发过敏反应，这部分抗原决定基被称为“表位”。过敏原含有两类抗原决定簇，T细胞抗原决定簇和B细胞抗原决定簇。一般T细胞抗原决定簇是线性表位，比较稳定。B细胞表位是分子内不连续的2～3个氨基酸残基折叠排列成的三维构象表位[20]。今后针对食物抗原决定簇线性作用表位以及影响IgE结合能力的关键氨基酸进行研究，开展过敏原线性抗原表位以及立体抗原表位的探索，从分子水平为致敏机理提供理论依据。

通过Fmoc固相肽合成法逐步缩合成肽端、藕联直至达到目的基因建立致敏蛋白肽图谱，确定其抗原决定簇。在此基础上基于Fmoc固相肽合成法，对于致敏蛋白进行定点突变，确定关键氨基酸调控位点。并以计算机辅助技术模拟蛋白质空间结构模型，从二级、三级结构确立其抗原决定簇。从分子学水平，线性表位和空间结构相结合，计算机技术辅助阐明其致敏机理。

分子水平上以单一蛋白为研究对象利用酶联免疫吸附试验、圆二色谱、ANS荧光探针和紫外光谱等检测方法，系统研究热加工对花生过敏原Ara h 2抗原性和结构的影响以及花生蛋白的构象发生改变后蛋白中已存在表位的破坏程度，从而进一步探讨其抗原变化机理[21]。

2.2 过敏原交叉反应性

近年来发现多种过敏原与其他同类或不同类的过敏原具有交叉反应性，这可能是由于不同蛋白质有共同的抗原决定簇所造成。现实生活中，同一属不同目的鱼小清蛋白较高的同源性使得免疫交叉反应存在。Thien对九种常见市售鱼进行研究，发现鳕鱼、鲑鱼、青鱼、雷公鱼具有严重的交叉反应，而比目鱼、金枪鱼则免疫性较弱[22]。某种程度上，了解各种过敏原交叉反应性发生原因往往会指导致敏机制的研究。花生过敏原Ara h2和Ara h6的生物信息学比较研究发现以Ara h6为模板同源建模可以得到Ara h2的立体结构，Ara h2和Ara h6的一级结构到三级结构极为相似，为交叉免疫奠定分子基础从而研究花生过敏机制[23]。

2.3 过敏原生物学特性

在研究蛋白致敏机制时，大量的致敏蛋白被证实是糖蛋白，例如小麦粉蛋白、大米致敏蛋白和大豆中的Gly m Bd 30K、Gly m Bd 28K蛋白。随着蛋白致敏机制的探索深入，此理论并不确凿。刘晓毅选择N－端糖苷酶作用富含糖链且是主要致敏原的7S球蛋白，通过免疫印迹研究脱糖链前后蛋白致敏性的变化情况[24]。根据实验得到7s球蛋白3个亚基均是糖蛋白，但是它们在糖苷酶的水解作用之后依然可以与患者血清IgE结合，所以糖链并非IgE结合的决定集团。

3 食物蛋白脱敏研究现状

常见的八大类过敏原具有极高的营养价值，所以预防过敏症的最佳方法不是禁止摄入此类食物，而是选择改良脱敏技术。目前食物蛋白脱敏技术大致分为三类：物理化学方法、酶法、生物技术方法。

3.1 物理化学方法

3.1.1 超高压技术

超高压可以改变分子间和分子内的非共价作用力，生物高分子物质立体结构的非共价键结合产生影响后，食物致敏性可能得到降低。曾有文献报道用超高压生产低过敏性的乳清蛋白制品。然而将纯化冻干的虾过敏蛋白装于超高压带中设定压强为100 MPa～500 MPa，分子量并未发生变化，原肌球蛋白的四级结构并没有解聚生成小颗粒亚基单位[25]。浓度2%的大豆蛋白溶液在自制高压静电场－30 KV、场直径147 mm的处理下致敏蛋白结构没有发生变化，抗原空间表位没有受到破坏，所以高压静电场作用不一定能够达到脱敏的效果[26]。

3.1.2 热处理技术

高温会引起蛋白质空间构象及三维结构的变化。因此食物加热到一定程度可以降低致敏性或去除过敏原。鲩鱼蛋白与IgE结合的阳性带主要有5条（51，39，27，23，10 kDa），随温度的升高、时间的延长、印迹条带逐渐减少到完全消失，说明加热一定程度可以去除过敏原的致敏活性[27]。

3.1.3 其他方法

Lee[28]等采用γ射线对鸡蛋白进行处理，结果表明在10 kGy的剂量下，致敏性卵白蛋白的含量减少了96%。说明辐照可以破坏过敏原空间结构，导致致敏性降低。虾过敏蛋白在849 W、35℃作用15 min，849 W、50℃作用15 min，999 W、100℃微波作用2 h后蛋白质分子量没有任何变化[29]。

3.2 酶法

抗原决定簇的三级结构可以通过木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等改变，使之失去原有的活性，也可通过断裂酰胺键降低过敏原的分子量来减弱其致敏性[30]。

酶法改性蛋白分为酶法水解蛋白技术和酶法交联技术。董晓颖用碱性蛋白酶、风味蛋白酶等五种酶在相同酶活下测定致敏蛋白水解能力，发现碱性蛋白酶在加酶量为1 000 U/g，pH 8.0、温度为60℃水解4 h后抑制率最大近似为0，致敏性完全消失[29]。胃蛋白酶和胰蛋白酶作用鲤鱼进行体外模拟消化过程后在半小时内胶原蛋白含量明显降解[30]，胃蛋白酶作用鲩鱼后分子量为 65，55，39，27 kDa 蛋白消失而 37 kDa 却依然顽固不变[31]。

酶法交联是通过转谷氨酰胺酶、过氧化物酶、多酚氧化酶使蛋白质聚集，使原先暴露在表面的过敏原表位包埋入蛋白质分子内部而消除其过敏原性。Chung等发现在37℃，pH8的环境下，用过氧化物酶处理烘烤花生60 min后花生中主要过敏原Ara h 1和Ara h 2减少的同时与IgE的结合能力减弱，这可能是由于致敏蛋白上的结合部位生成多聚体而被掩蔽[32]。

3.3 生物技术方法

3.3.1 发酵法

建立发酵过程是改善食品致敏特性的新思路，有待成为食品蛋白质脱敏过程的一项新型技术。胡晓萍向100 ml含有2%大豆蛋白、2%葡萄糖液态培养基中接种107个/100 mL雅致放射毛霉、米曲霉、少孢根霉以及少根根霉后致敏性均下降60%以上[33]。

3.3.2 基因工程法

美国科学家在上个世纪90年代就利用生物技术将大豆中过敏蛋白的基因去除，这项将蛋白中主要过敏原从食物中脱除的技术在人类历史上尚属首次。转基因引发过敏性风险上升的同时需要逆向考虑此项技术可以减少食物中过敏蛋白。目前已报道两种方法：反义基因和共抑制技术抑制基因表达[34]。

3.4 展望

3.4.1 低过敏及抗过敏食品开发

食物过敏严重影响部分人群的生活质量，目前尚无特效疗法。只有对食品进行相关基础研究以寻找新途径消除或降低食物中的过敏原活性，上述脱敏技术以及n－6和n－3系多价不饱和脂肪酸、多酚类等抗过敏因子的应用即可达到低过敏和抗过敏食品的开发。

刘晓毅采用分离和酶解两步工艺专一性去除大豆主要致敏蛋白中7s球蛋白中的α亚基获得低致敏大豆制品[35]。汪宁对沙丁鱼、金枪鱼和鲭鱼漂洗加工后制成鱼糜制品，过敏原含量有很大程度的降低；另外对3种鱼罐头进行免疫印迹，均未能检测到对应的特异性条带[36]。所以鱼糜和高温高压的鱼罐头都可以被认为是低致敏性食物。

3.4.2 过敏原检测技术

防治过敏尤为重要的是低过敏食品的大力研发以及食物过敏源快速有效检测的方法开发。

临床上诊断致敏原是否激发过敏反应包括皮肤针刺试验、排除性膳食实验、血清特异性IgE水平测定和食物刺激实验（开放和双盲对照）；而检测蛋白质残余与降解情况则对体外热稳定性和消化稳定性进行实验[37]。开发高通量灵敏的抗过敏食品安全检测手段包括免疫微阵列、蛋白质芯片、生物传感结合特异性IgE 检测[38]。

4 结语

食物过敏威胁儿童健康、影响成人生活，是食品安全事件中不可避免的问题。在国内外食品来源多样化的今天，大量科研工作者已经开展对食物中过敏成分的深入研究。由于食物过敏不可逆转并且难以根治，因此，摸索食物过敏机制以研发低过敏食品就成为我们当今科研课题中的重中之重。

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