NSCLC患者血清miR-181a的表达变化及其与铂类药物化疗敏感性的关系

金建华，陆文斌，邓建忠，张 华，王 芳，王 月，金丽艳

(江苏大学附属武进医院，江苏常州213002)

肺癌是严重威胁人类生命健康的常见恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌(NSCLC)多见［1］。许多NSCLC患者(特别是早期患者)症状并不明显，很难作出早期发现、早期诊断，达临床晚期时手术切除率低，且存在化疗抗药性。因此，寻找有效肿瘤分子标记物指导临床早期诊断和优化个体化治疗是目前临床的迫切需求。微小RNA(miR)是一种新近发现的具有调控基因作用的非编码短序列RNA，其在肿瘤发生过程中扮演抑癌和致癌基因角色［2］。近年研究发现，miR在人外周血中稳定表达，可作为一种潜在肿瘤标志物对肺癌进行早期诊断，且miR表达异常可通过靶向调控药物外排泵分子、细胞周期蛋白或凋亡调节蛋白等不同途径介导肿瘤细胞的耐药，与肿瘤化疗敏感性相关。2010年1月～2012年5月，我们采用茎环结构的逆转录实时定量PCR法检测了NSCLC患者早期手术前及术后含铂方案化疗前后血清miR-181a表达情况，旨在探讨后者在早期NSCLC诊断中的意义及与铂类药物化疗敏感性的相关性。

1 资料与方法

1．1 病例来源 江苏大学附属武进医院胸外科和肿瘤科收治的早期NSCLC患者40例(NSCLC组)，男25例、女15例，年龄45～75岁(中位年龄55岁)。均留取手术前血清标本，术前均未行放疗、化疗等抗肿瘤治疗;其中30例术后接受至少2个周期的含铂方案化疗(均经CT扫描证实具有可测量的肿瘤病灶，化疗前功能评分均＞60分，血常规、肝肾功能、凝血功能、心电图无特殊异常)，其中有效(完全缓解或部分缓解)18例、无效(稳定或进展)12例，均留取化疗前后血清标本。所有病例均经病理检查确诊，腺癌18例、鳞癌22例。按照2009年国际抗癌联盟(UICC)标准，Ⅰ/Ⅱ级23例、Ⅲ级17例;T1～T2期21例、T3～T4期19例，N0期15例、N1/N2期25例，M0期33例、M1期7例。选择40例同期无肺部病变的健康体检者为对照组，男27例、女13例，年龄45～70岁(中位年龄53岁)。两组一般资料具有可比性。

1．2 主要试剂与仪器 miRcute miRNA提取分离试剂盒购自北京天根生化科技有限公司;dNTPs，MMLV逆转录酶，RNA酶抑制剂，逆转录缓冲液，DTT，均购自美国Invitrogen公司;SYBR Green荧光定量PCR检测试剂盒购自中国TaKaRa公司。普通PCR仪购自美国BIO-RAD公司，Mx3000p Real Time PCR仪购自美国Stratagene公司。所用引物均由广州锐博生物科技有限公司合成。

1．3 血清miR-181a检测 ①血清总RNA提取:严格按照miRcute miRNA提取分离试剂盒说明书步骤进行，并用DEPC水溶解。用核酸蛋白分析仪检测提取RNA 的浓度和纯度。OD260/OD280值均在1．8 ～2．0。②miRNA茎环反转录:分别取总RNA 400 ng进行miR-181a及U6的逆转录反应。采用10μL体系:总RNA 0．5 μg，62．5 nmol/L 逆转录引物1 μL，加灭菌蒸馏水补至6μL，70℃ 10 min预变性，冰上2 min;加入dNTPs 0．5 μL，灭菌蒸馏水0．55 μL，DTT 0．3 μL，逆转录缓冲液2μL，RNA酶抑制剂0．15μL，MMLV逆转录酶0．5 μL，42 ℃ 60 min，70 ℃ 10 min，4 ℃保存。③荧光定量PCR:PCR总反应体系为10μL:cDNA lμL、2×SYBR Green Taq反应液5 μL、RoxП0．2 μL、10 μmol/L正反义引物各0．2μL。通过Mx 3000p real time PCR扩增仪检测。反应参数:94℃ 10 s，94℃ 5 s，60℃34 s，共40 个循环。PCR 数据结果用2－ΔΔCt法［3］进行相对表达量(中位数)分析。

1．4 统计学方法 采用 SPSS16．0统计软件进行统计分析(茎环结构实时荧光定量PCR结果为非正态分布资料)。对两组独立样本资料之间比较采用Mann-Whitney U检验，配对资料之间比较采用Wilcoxon检验，多组资料比较用Kruskall-Wallis H检验。P≤0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 NSCLC组术前血清 miR-181a表达及与临床病理特征的关系 NSCLC组术前和对照组血清miR-181a 表达量分别为 0．002 59、0．007 29，组间比较P＜0．000 1。NSCLC组术前血清miR-181a表达与肿瘤临床病理特征之间无统计学相关性，见表1。

表1 术前血清miR-181a表达与NSCLC临床病理特征的关系

2．2 NSCLC组术后化疗患者血清miR-181a与铂类药物化疗疗效的相关性 NSCLC组化疗前后血清miR-181a相对表达量分别为 0．002 79、0．006 25，P=0．000 1;NSCLC组化疗无效、有效者分别为0．004 56、0．007 93，化疗无效者显著低于化疗有效者及对照组(P 分别为0．015、0．005)，后两者比较无显著差异(P=0．806)。

3 讨论

肺癌发病率和病死率一直列居恶性肿瘤前列，其发生是多因素、多阶段发展的复杂过程。NSCLC占全部肺癌的70%～80%，很多患者在确诊时已为晚期。因此，迫切需要寻找理想的肿瘤标志物提高非小细胞肺癌的早期诊断率，并监测患者的疗效、复发及转移情况。miR是真核生物中一类长度约为22个核苷酸、参与基因转录后水平调控的非编码小分子RNA。研究发现，肺癌、肝癌、肠癌、卵巢癌和白血病等多种恶性肿瘤中miR的表达谱具有明显组织特异性［4］，且miR比RNA更为稳定，在室温下过夜、反复冻存—解冻、煮沸、过酸或过碱等条件下仍能稳定表达［5］，故血清miR可能是较为理想的肿瘤标记物。研究［6］表明，miR-21、miR-143 和 miR-181a与NSCLC关系密切，在癌组织中显著异常表达，且组织中miR-181a低表达与患者不良预后显著相关，可能成为NSCLC的早期诊断标志物。但血清miR-181a表达水平与NSCLC的关系尚不明确。本研究采用茎环结构的实时荧光定量PCR法检测了miR-181a在40例早期NSCLC患者及对照组血清中的表达水平，结果显示血清miR-181a在NSCLC组术前的表达量明显低于对照组，提示外周血miR-181a可能是一种较好的与NSCLC早期诊断有关的肿瘤标记物;此外，血清miR-181a表达与NSCLC患者年龄、性别、吸烟状况、病理类型、TNM分期、浸润深度、淋巴结转移及远处转移无统计学相关性，有待进一步扩大标本量及改善统计方法进行深入研究。

目前，治疗晚期NSCLC最主要的方法仍为以铂类药物为基础的化疗，而耐药成为临床化疗失败最常见和最难克服的问题，通过相关指标检测预测铂类药物的敏感性成为个体化化疗研究的热点问题。细胞凋亡程序缺陷是目前铂类耐药的主要机制之一。近年研究表明，miR表达异常可通过靶向调控各种凋亡调节蛋白等干预凋亡过程，从而改变肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。Galluzzi等［7］研究发现，miR-181a是凋亡相关的重要miR之一，可调控铂类药物诱导的癌症细胞的凋亡。另外Francesca等［8］和Shi等［9］研究结果显示，miR-181a可显著促进白血病和脑胶质瘤细胞的凋亡以及对化疗药物的敏感性。房栋等［10］也在体外实验中发现，miR-181a/b可通过靶向抑制多种抗凋亡蛋白表达，显著增加耐药肺癌细胞对顺铂的敏感性。本研究发现，血清miR-181a水平在化疗无效者明显低于化疗有效者和对照组，而后两者比较差异无统计学意义。证实血清miR-181a水平可能与NSCLC铂类药物化疗敏感性相关。本研究不足之处在于病例数相对较少、统计学效应有一定限制，未发现血清miR-181a表达与早期肺癌临床病理特征的相关性。下一步我们将进行更大样本量的重复实验，并探索联合检测其他相关miR的研究，以期发现更多血清肿瘤分子标记物在NSCLC早期诊断中的作用及与化疗药物敏感性的关系。

综上所述，miR-181a在早期NSCLC患者血清中的水平降低，并与铂类药物化疗敏感性相关;可作为潜在的生物标记物用于NSCLC的早期诊断及化疗敏感性预测。

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［8］Francesca F，Ivan V，Muller F．MicroRNAs:tiny players with a big role in the pathogenesis of leukemias and lymphomas［J］．Hematol Rev，2009，1(1):e8．

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［10］房栋，徐静，朱伟，等．miR-181a/b靶向抑制多种抗凋亡蛋白表达对肺癌细胞顺铂耐药的影响［J］．南京医科大学学报(自然科学版)，2012，33(12):1690-1695．