长期保存绵羊冻精的解冻活力与受胎效果观察

杨菊清 ，杨风云 ，张增强 ，周新华 ，窦来义 ，周光瑞 ，谢鹏贵，别尔克博尔·博洛提汉

（1.伊犁职业技术学院，新疆伊宁 835000；2.新疆巩乃斯种羊场；3.新疆生产建设兵团农四师七十九团畜牧中心；4.新疆美利奴细毛羊科技发展有限责任公司；5.新疆维吾尔自治区畜牧总站）

我国成功制作的第一批澳洲美利奴种公羊颗粒冻精迄今为止已保存了30多年，为了检验其保存效果，作者等根据不同时期细毛羊育种需要，曾陆续在不同细毛羊育种场共进行过8次输精试验，各次试验汇总平均受胎率37.69%，平均产羔率114.33%。在试验过程中，对这批颗粒冻精在不同试验年限解冻后不同活力精液的受胎与产羔情况进行统计分析，结果如下。

1 材料与方法

1.1 试验精液冻制背景

1972年1月，我国从澳大利亚进口了29只纯种澳洲美利奴（中毛型）种公羊，其中分配给新疆巩乃斯种羊场6只。这些公羊使用方向：一是为新疆毛肉兼用细毛羊导血，以提高其羊毛产量和净毛率，改善体型外貌、羊毛品质；二是与新疆毛肉兼用细毛羊、新波及波尔华斯母羊级进杂交以培育中国美利奴羊。为了进一步充分利用澳洲美利奴种公羊的优良基因，最大限度地挖掘其改良潜力和遗传资源，由新疆巩乃斯种羊场、新疆畜牧研究所（现为新疆维吾尔自治区畜科院畜牧所）和新疆畜禽改良总站（现为新疆畜牧总站）有关科技人员组成新疆冻精研制协作小组，在1975年12月—1976年1月期间，共同冻制了用于长期保存试验的第一批颗粒冻精。冻制冻精时，6只种公羊的平均年龄6.5岁，平均体重89.7 kg。由于配种任务十分繁重，故冻制冻精的时间选在了非配种季节［1-2］。

1.2 精液的冻制与保存

在精液采集与冻制期间，澳洲美利奴种公羊采取全舍饲方式饲养管理，由专人管护。每天投喂苜蓿干草3 kg，混合精饲料（含燕麦、麸皮、油渣、豌豆）1 kg，胡萝卜1kg，鸡蛋1枚，早、晚各驱赶运动2 000 m，每天采精2次。采精室温度为17.8℃，制冻室温保持在22.2℃。采集的原精液量平均1.0 mL（0.9～1.1），活力0.9～1.0，精子密度30亿/mL（20～34亿）。精液按1∶1比例进行稀释。稀释液的主要成分包括乳糖溶液、新鲜卵黄、甘油，加青、链霉素若干。经稀释后的精液，先在0～5℃下平衡4 h，在干冰下制成颗粒，剂量0.1 mL/颗，每剂冻精颗粒中的有效精子数不低于4 500万个，冻制后浸于液氮中保存。冻精制成后，存放在新疆畜禽改良总站，用于长期保存。

1.3 试验羊群

本批冻精的系列输精试验先后在新疆巩乃斯种羊场、乌鲁木齐南山种羊场、温泉种畜场和新疆美利奴公司尼勒克基地等细毛羊种畜场或养殖场进行［3-5］。所有参加颗粒冻精输精试验的生产母羊均由各试验羊场提供。入选的母羊年龄2～7岁（个别优秀者还放宽到8岁）、配种时体重45 kg以上，身体健康、无生殖道疾病、被毛细度64～66支（20.1～23.0 μm）。所有参加冻精输精的母羊均系自然发情，每天凌晨采用试情公羊试出。

1.4 冻精解冻与输精

1.4.1 冻精解冻 在进行本系列试验期间，颗粒冻精采用了干解冻法和湿解冻法2种方法进行解冻［4］。干解冻法（1978—1995年）：在消毒好的试管里放入2个冻精颗粒，在80℃温水里快速解冻；湿解冻法（2008年）：先在小试管中加柠檬酸钠液0.5～1.0 mL，旋转一圈后倒出，将管壁上剩余的少许液体加热至40℃，投入2个冻精颗粒后，在40℃温水中水浴。2种解冻方法都要求待颗粒溶解到1/3时取出试管，手搓至完全解冻。解冻后立即进行镜检，活力评分采用“0～1等级”的十级分制加以评定。

1.4.2 输精 冻精输精在系列试验的8次输精过程中，分别采用了常规子宫颈口深部输精法（5次）和腹腔镜子宫角输精法（3次），每种方法输精量均0.2 mL，含有效精子数在0.6亿个以上。常规方法（1975年、1977年、1980年、1986年）：采取子宫颈深部输精，每次输解冻冻精2颗（0.2 mL），上午和下午各输精1次；参加2008年试验的羊只仅在上午输精1次，下午不再输精，仅少数发情持续时间长的母羊，如果第2天仍然被试情公羊试出，就用原配种公羊冻精再输精1次。腹腔镜子宫角输精（1987年、1991年、1995年）法：将试验羊固定于保定架上，抬高后躯，术部经消毒后用气腹针充气。使用套管针在母羊腹部靠近乳房约3 cm处扎孔，分别插入内窥镜和拨棒。开启电源后，在拨棒的帮助下找到子宫角。然后在子宫角靠近输卵管的1/3处扎入输精器，将精液缓慢输入，每侧子宫角输冻精1颗（0.1 mL），共输精0.2 mL。输精后缓慢抽出输精器及内窥镜、套管、拨棒。最后消毒伤口，将试验羊只放下手术架，即完成整个冻精输精过程。

1.4.3 记录 输精的同时做好相关记录，登记项目包括：输精时间、公母羊号、精液活力、输精量、输精次数、复发情与复配情况及输精时的气温状况描述。由于第一批澳洲美利奴种公羊的冻精来之不易，为了不浪费宝贵的精液，解冻活力评分0.1的冻精也进行了输精并做了特别注明。

2 结果与分析

2.1 解冻活力

统计的冻精解冻后的活力情况详见表1。在本系列试验中，累计使用澳洲美利奴种公羊颗粒冻精2 600粒，统计的有效解冻冻精共1 291剂计2 582粒，精液解冻后在恒温环境下镜检。按常例绵羊精液经过冻制后，其解冻后的活力通常不及原精液未冻制前的一半水平。本批冻精保存后，曾经多次进行活力抽检，目测活力一直保持在0.3～0.4之间，远低于鲜精时0.9～1.0的活力评分水平。在统计镜检的1 291剂解冻冻精中，活力评分在0.4分以上者极少，如评分0.5者仅5剂占0.39%、评分0.4者也仅44剂占3.41%，而活力评分为0.2～0.3者1 080剂占到总剂数的83.65%；试验现场镜检与实验室抽测目测的结果之间有些差异，这可能是由于试验时间跨度长、参加人员多，对解冻活力的评估可能存在一定的主观偏差所致。各次试验解冻后精液的活力在0.3以上者（含0.3者）平均占到解冻冻精总剂数的53.14%，其中该批冻精在保存32年时，解冻后精液的活力为0.3者占到60.56%，与保存0年时的数据相比仅有2.1%的降幅。通过统计数据分析比较，不同保存年限对精液的解冻活力没有影响（P ＞0.05），在此前的报道已有明确阐述［5］。

表1 澳美羊冻精不同保存年份解冻活力

2.2 受胎效果

本批澳洲美利奴种公羊颗粒冻精在8次系列输精试验中，合计输精963只生产母羊，其中363只母羊产羔，共生产羔羊415只，受胎率分别为20.78%、32.0%、50.0%、42.31%、46.58%、41.46%、32.29%和32.39%，平均受胎率37.69%、平均产羔率114.33%［4］。其中保存到第32年时的受胎率虽然为32.39%，但经过生物统计学处理，与早期的常规输精试验结果比较，差异均不显著（P＞0.05）［5］，以此说明这批冻精虽经过长达30多年的保存，未显著影响到其受胎效果。但是试验数据表明，冻精解冻后的活力评分对受胎率及产羔率的影响都较大，详见表2。

从试验结果统计数据可见，冻精解冻后的活力越好，输精后母羊的受胎率和产羔率就越高。不同解冻活力的冻精输精后受胎率之间差异极显著（P＜0.01），其相对应的产羔率也差异显著（P＜0.05），随着解冻活力的提高受胎率和产羔率都表现出迅速提高的趋势，解冻活力评分每提高0.1分，平均受胎率提高9.32个百分点，平均产羔率提高8.33个百分点。在试验中观察到有5剂冻精得到了0.5的最高活力评分，输精后有3只羊成功受孕，并产羔4只，受胎率和产羔率分别为60.00%和133.33%。而解冻活力在0.3者637剂输精480只生产母羊，生产羔羊246只，受胎率44.79%，产羔率114.41%，受胎率与产羔率均都显著低于前者（P＜0.05）。按照冻精输精规程的相关规定要求，低活力冻精（0.2及以下）不能用于输精用，但是为了不浪费精液，这些活力低下的精液也进行了输精，并取得了意想不到的收获：162剂活力评分为0.1的冻精输精101只母羊后，获得了23只羔羊，受胎率达22.77%。这些羊只虽然受孕产羔，生产的羔羊绝大多数均为单羔（95.65%），仅有1例双羔（4.35%）。低活力冻精输精取得的受胎率（22.77%），笔者认为有可能是在主观评分时发生判断误差所致。

表2 不同解冻活力澳美羊冻精输精及产羔情况

采取的输精方法不同得到的受胎效果也不同（见表3）。比较分析证实，采用腹腔镜绵羊宫内输精的效果都要高于常规宫颈输精方法，两者之间差异极显著（P＜0.01），5次常规输精的平均受胎率31.49%，双羔率只有4.05%，总体效果不如腹腔镜绵羊宫内输精，而且产羔率也较后者低17.35个百分点。统计数据显示，在同样活力水平下，腹腔镜输精的受胎率高于常规输精，其中在0.1、0.2、0.3活力水平时，两种方法的受胎率分别相差12.18个百分点、14.34个百分点和29.42个百分点，说明活力好的冻精采取腹腔镜输精效果会更好。但采取腹腔镜输精法的母羊平均产羔率为111.89%，低于采用常规输精法4.29%，由此可以证明产羔率与母羊的发情排卵状况之间的关系密切，与配种输精方式之间没有必然的联系。

表3 不同解冻活力冻精输精方式及产羔情况

3 讨论

本批试验的颗粒冻精是我国最早制作的美利奴型种公羊冻精之一，当时我国绵羊精液冷冻保存技术刚刚起步，稀释液的筛选、平衡、冷冻、解冻的适宜温度等整个工艺操作技术才开始探索。因此，本试验使用的颗粒精液制作时技术尚未完全成熟。随着生物冷冻技术的不断提高和改进，颗粒型冻精由于精子复苏率和受胎率较安瓶型与细管型冻精要低，且有易受污染、不便标记等缺陷，已逐步被适合于机械化生产又能克服上述缺陷的细管型冻精所取代。尽管如此，本系列试验经过不同的保存时间、不同试验地点和不同试验条件下的输精效果观察，确证了本批颗粒型冻精的冻制质量。

通过对不同试验年限解冻后的不同活力精液受胎情况的统计分析，也说明长期冷冻保存的绵羊精液，只要保存得当，其解冻活力与受胎效果是不会因为保存年限的递增而衰减，至少截止目前的保存年限里，没有发现衰退趋势。同时，绵羊精液在冷冻制作过程中，对精子本身产生的伤损作用，采用腹腔镜输精子宫角输精法进行输精，可以缩短精子的游走距离，降低精子的运动能耗，从而有效地提高受胎率和多胎率。统计结果表明，冻精解冻的活力越好，使用腹腔镜输精受孕的几率越大，因而，在使用长期保存的绵羊冻精进行配种时，采用腹腔镜输精子宫角输精法效果要更好。

［1］胡连志，杨菊清，郭文惠.腹腔镜绵羊宫内输精初试［J］.中国畜牧杂志，1989，25（5）：22.

［2］胡连志，徐佩贤，段长存.冷冻保存十五年的绵羊精液受胎效果［J］.草食家畜，1993（3）：20.

［3］田可川，阿扎提，史梅英，等.保存20年的美利奴羊冻精腹腔镜输精试验［J］.中国畜牧杂志，1999（1）：33.

［4］杨菊清，张增强，周光瑞，等.绵羊冻精不同保存年限的受胎效果连续观察［J］.草食家畜，2009（3）：40-43.

［5］周光瑞，杨菊清.长期保存的绵羊冻精输精受胎效果观察［C］//2010年新疆畜牧兽医学会年会论文集.新疆畜牧兽医学会内部资料，2010：1-3.