自然寄生松墨天牛虫生真菌的分离、鉴定及其生物学特性的研究

蒲顺昌，刘玉军，葛永斌，燕傲蕾

（1.亳州师范高等专科学校，安徽 亳州236800；2.安徽农业大学 省微生物防治重点实验室，安徽 合肥230036）

松墨天牛Monochamus alternatus是我国松树的重要蛀干害虫，也是松树病害松材线虫病Bursaphelenchus xylophilus的主要媒介昆虫。在松材线虫扩散和侵染过程中，松墨天牛起着携带、传播和协助病原侵入寄主的关键性作用［1－2］。松材线虫病是一种特大毁灭性森林病害，对我国松林资源、自然景观和生态环境造成了严重的破坏。因松材线虫发生在松树木质部，防治难度较大，故防治松墨天牛是有效控制松材线虫病传播的重要手段［3］。由于松墨天牛幼虫生活隐蔽、成虫羽化期长，化学防治极其困难，并且会造成污染环境［4］。真菌杀虫剂具有不污染环境，并能有效地在林间宿存和流行的特点，生物防治专家在利用真菌防治松墨天牛方面做了大量的工作，认为球孢白僵菌Beauveria bassiana是松墨天牛生物防治最具潜力的病原之一［5－7］。为探讨使用白僵菌防治松墨天牛的有效途径，有必要对分离自同一区域、同一寄主，但不同时间的8株球孢白僵菌菌株进行生物学特性的研究，旨在为筛选出对松墨天牛成虫具有高毒力生产菌株奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试8株球孢白僵菌菌株全部分离自安徽黄山松林中野外感病死亡的松墨天牛成虫。经过室内分离及形态鉴定，均为球孢白僵菌菌株，菌株均保存于安徽农业大学微生物防治省重点实验室。

1.2 培养基［8］

PPDA培养基（成分为：马铃薯200g，葡萄糖30 g，琼脂20g，酵母10g，水1 000ml）。SDAY培养基（成分为：葡萄糖40g，琼脂20g，酵母10g，蛋白胨10g，水1 000ml）。

1.3 标本分离与培养［9］

采用松墨天牛僵虫体表分生孢子划线分离法进行分离。为防止其它杂菌污染，使用加入氨苄青霉素（0.4g），盐酸链霉素（1g），水（1 000mL）的SDAY培养基进行培养。

1.4 标本鉴定

在标本室内观察分离纯化的菌株，并记录菌落的色泽、形态、生长速度等培养性状。挑取少许菌株初产孢的培养物，用玻片熏蒸固定法制成临时载玻片，在数码显微镜下观察各菌株的孢子形状与大小。

1.5 不同菌株生物学特性的研究［10］

1.5.1 菌落生长性状观察

等量点接供试菌株的新鲜菌落到PPDA平板，恒温25±1℃培养，封口膜封口，每菌株3个重复。每天观察菌落的生长、色泽、形态和产孢等情况，在培养的第14d采用十字交叉法分别测量各菌株的菌落生长直径。

1.5.2 产孢量测定

将培养基上培养14d的菌落，用直径为13mm的打孔器从每一菌落的中心点至边缘距离的1/2处打孔截取小菌块，每菌株3个重复。然后将小菌块加入0.05%吐温80（w/v）水溶液，经磁力搅拌器搅拌10min，获孢子悬浮液，用血球计数板在显微镜下计数。

1.5.3 孢子萌发率测定

将孢悬液用微量移液器吸取15μL滴在2%琼脂的载玻片上。做3个不同重复，置于25±1℃的条件下培养。镜检稀释至每个视野有20～30个孢子，24h后在显微镜下取10个不同视野（不少于100个孢子）镜检萌发率。

根据观察数据计算孢子萌发率，即：孢子萌发率＝（发芽孢子数）/（总孢子数）×100%。

1.6 数据处理

试验数据应用SPSS17.0数据处理系统进行统计分析，试验结果经方差分析后进行Duncan's多重比较检验各处理间的差异显著性（P＝0.05）。

2 结果与分析

2.1 形态及分子鉴定

经室内分离培养，其形态特征如下［11］：菌株在PPDA上外观似毡状、绒毛状或粉状，色泽白色，基质色泽黄色，无孢梗束，无明显气味，菌丝光滑。菌落生长较快，14d后，直径达到3.2～4.9cm。分生孢子梗多着生于营养菌丝上，分生孢子浓密簇生分生孢子梗上，球形至瓶形，颈部轴上具明显的“之”字形弯曲，在分生孢子梗或菌丝上聚成紧密的孢子头。分生孢子球形或近球形，大小为2.1～2.9μm×1.6～2.3 μm。从菌落形态和分生孢子的形态特征将其全部鉴定为球孢白僵菌。通过ITS－DGGE电泳检测发现，这些菌株在条带上无明显差异，并未出现像Pu等［12］通过PCR－DGGE电泳技术研究白僵菌基因分型中出现显著差异条带的假球孢白僵菌［13］。因此，根据形态特征和分子数据，将这8株来自松墨天牛虫的病原真菌鉴定为狭义球孢白僵菌。

2.2 生物学特性研究

菌株营养生长快慢是反映菌株优良性状指标之一。对8株菌株进行营养生长的比较测定，获得菌落平均生长直径及产孢量值（表1）。由表1可知，8株球孢白僵菌菌株之间营养生长有明显差异。以Bb660生长最快，14d时菌落直径为48.26mm，显著高于其他7个菌株。

同时，菌株Bb660的产孢量明显优于其他各菌株，其中产孢量最高的菌株Bb660比最低的Bb408要高2.3倍，产孢量最小的菌株Bb408仅为0.53×108个/mL。产孢量是菌株的重要评价指标，同时也与侵染能力及扩散范围具有很大的相关性。

此外，各菌株间24h孢子萌发率均超过80%，说明8株菌株均具有较强的萌发能力，但也存在着显著性差异。Bb660孢子平均萌发率最高，24h的孢子平均萌发率分别为97.48%，而孢子平均萌发率最低的Bb398也达到了80.67%（表1）。

表1 球孢白僵菌不同菌株的生长、产孢及萌发情况

3 讨论

应用虫生真菌防治松褐天牛时，天牛成虫由于与释放菌株接触机会多，因而是防治的关键虫期。虫生真菌由于受到野外高温、干旱和紫外线等多种环境因子的影响，对其林间应用效果产生了重要的制约。因此，对室内筛选的菌株，还需结合菌株的其他特性，如抗高温能力、抗旱能力和抗紫外线能力等指标进行综合评价。

本试验仅对8株球孢白僵菌菌株进行了生物学特性的研究，下一步还需对松墨天牛卵、幼虫及成虫的致病能力进行研究，以便筛选出高毒力菌株，对松墨天牛各个虫期采取有针对性的防治措施提供科学依据。目前，在林间喷雾、喷粉法防治森林害虫中，真菌孢子很难接触到树干内的天牛幼虫，优良菌株很难完全发挥效用，这是蛀干害虫防治中的难题。针对天牛类蛀干害虫而开发的长持效期新型菌剂无纺布菌条已经用于多种天牛类蛀干害虫的防治［14－16］。此外，利用引诱剂防治松墨天牛已成为近年来研究的热点［17－19］。因此，可以利用引诱剂结合无纺布菌条联合防治松墨天牛，以提高球孢白僵菌对该类天牛的防治效果。

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