四种海螺中左卡尼汀及其酰化物含量比较

曹 玉，王晨静，赵 霞，李存友，王宏广，王春波，管华诗

(1中国海洋大学医药学院，山东青岛266100;2青岛大学医学院附属医院;3青岛大学医学院)

左卡尼汀(LC)，又叫左旋肉碱、肉毒碱、维生素BT，与其酰化产物乙酰左卡尼汀(ALC)和丙酰左卡尼汀(PLC)等共同构成人体内的卡尼汀群，是动物体内脂肪代谢不可缺少的营养素，在食品加工、动物养殖、医疗保健等领域应用广泛［1］。目前，关于LC的研究多集中在牛、羊等肉类食品，在海洋产品中研究较少，而同时观察海洋产品中LC及其代谢产物的研究鲜见报道。斑玉螺、疣荔枝螺、海螺、钝拟蟹守螺均为海洋中药食两用的海洋产品，是沿海地区居民餐桌上的常见食品。2012年5～12月，我们采用荧光衍生化高效液相色谱法(HPLC)对4种海螺中LC、ALC、PLC的含量进行了检测，以期为我国海洋螺类药用资源的开发以及沿海地区居民通过海洋食品摄入LC提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 实验仪器:Waters2695高效液相色谱仪、Waters474荧光检测器(美国 Waters公司)，HL130HS血液透析仪 (埃及 Haidylena公司)，METTLER AE240电子天平(博特勒—托利多仪器上海公司)，Milli-Q Biocel纯水发生器［密理博(上海)贸易有限公司］，离心机(德国雅培公司)，MS1 Minishaker涡旋振荡器(Minishaker公司)。药品及试剂:LC、ALC、PLC、1-氨基蒽(1-AA)均购自 Sigma 公司，1-乙基-(二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)购自 Fluka公司，乙腈(色谱纯)购自美国Honeywell International Inc，丙酮、乙醚、氯仿、乙酸铵等均为国产分析纯。斑玉螺、疣荔枝螺、海螺、钝拟蟹守螺均为鲜活海螺，购自青岛台东水产批发市场。

1.2 方法

1.2.1 样品提取及制备 ①样品及空白样品提取:分别取4种新鲜海螺肉50 g，加入3倍量的3%高氯酸溶液，匀浆机中匀浆3 min(3 000 r/min)，3 000 r/min离心10 min，取上清液，用 NaOH调整 pH为7.8。取5 mL，－20℃冷冻保存待测。其余样品置入血液透析器中，4℃下用1.5%腹膜透析液1.5 mL/min透析24 h后分装冻存，用于配置标准品。②衍生化试剂:取1-AA 160 mg，丙酮溶解至10 mL，即得EDC溶液。取EDC 1 600 mg，用0.01 mmol/L磷酸二氢钠溶液(pH 3.5)溶解至10 mL。

1.2.2 标准曲线配置 分别取LC(9.88 mg)、ALC(4.79 mg)、PLC(6.39 mg)，用水溶解至 10 mL，精密量取适量，加入空白样品溶液，配置混合标准液，其中 LC 浓度分别为 5、10、20、50、100、200、400、800 μmol/L，ALC 浓度分别为0.4、1、2、4、10、20、50、100 μmol/L，PLC 浓度分别为 0.2、0.5、1、2、5、10、25、50 μmol/L。

1.2.3 高效液相色谱条件 色谱柱:Hypersil C18柱(4.6 mm ×200 mm，5 μm);流动相:0.1 mol/L 乙酸铵—乙腈(67∶33);流速为1.0 mL/min;波长:Ex 248 nm，Em 418 nm;进样量:50 μL。

1.2.4 LC、ALC、PLC 含量检测 取各样本的标准样和待测样提取液100μL，加入500μL乙腈沉淀蛋白，10 900 r/min离心5 min，取上清液500μL，加入400μL磷酸缓冲液(pH 3.5)，20μL稀盐酸(1 mol/L)，混匀后加入1-AA溶液100μL，缓慢加入100μL EDC，室温避光衍生化30 min。然后用乙醚(3 mL)萃取2次，弃掉乙醚相，在水相中加入800 μL磷酸缓冲液(pH 9.1)，涡旋后用氯仿(3 mL)萃取2次，取水相400μL，加同等量的磷酸缓冲液(pH 3.5)，混匀后取50μL进样分析。取每种海螺的各浓度标准溶液6份，处理后进样分析，以峰面积的均值为纵坐标，以标准溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线，通过精密度、回收率、稳定性实验进行方法学考察，每种海螺分别取6份待测样品，分别计算浓度，取平均值，得到待测样品的浓度，计算每100 g样品中含有LC、ALC、PLC的量。

2 结果

2.1 选择性实验结果 取空白样品、标准溶液、提取样本处理后进样分析，得空白样品色谱图、标准溶液色谱图和待测样本色谱图(为钝拟蟹守螺的色谱图，其余三种产品色谱图相似，略)。见图1。结果显示，在测定时间范围内，空白样品无测定成分的干扰;标准溶液中 LC、ALC、PLC 分别在 7.233、10.328、14.137 min 出峰，峰形良好，分离完全，无干扰;待测样本中分别在对应的保留时间内检测出相应的成分。

图1 钝拟蟹守螺的LC、ALC和PLC高效液相色谱图

2.2 标准曲线 荧光衍生化HPLC精密度＜4%、回收率96% ～103%、稳定性＜3.8%，证明该方法稳定、准确、灵敏，能达到检测的目的。其标准曲线方程以及检测限、相关系数见表1。

2.3 各样品LC、ALC、PLC含量 见表2。

3 讨论

LC是由俄国科学家Guliewitsch和Krimberg于1905年在肌肉提取物中发现的［2］，并鉴定其结构式为L-β-羟基-γ-三甲氨丁酸。它的基本功能是与长链脂肪酸结合，带动长链脂肪酸向线粒体内膜的转运，使脂肪酸在线粒体酶的作用下发生β-氧化，再将脂肪酸β-氧化的产物转运出线粒体，最终有利于脂肪的进一步分解［3，4］。人体内的卡尼汀群来源主要有内源性和外源性两种，内源性的LC主要在肝、肾和大脑中合成［5］;外源性的主要来自药物和肉类食品［6］，正常人体内的LC 25%自身合成、75%来自食物，在动物的骨骼肌中含量最高。1993年美国FDA专家委员会确认LC安全、无毒，美国药典第23版开始收载LC原料和制剂。LC在医疗上主要用于治疗慢性肾疾病引起的肉碱缺乏、心肌疾病和心率失常、调节血脂及血压等，在神经系统疾病、内分泌系统疾病以及减肥和男性不育症也有效果;作为保健品和食品添加剂可用于减肥、运动保健、抗衰老、婴儿奶粉以及其他食品中;作为饲料添加剂添加在水产养殖饲料中，可以提高生长速度，降低饲料系数，改善鱼肉品质，提高鱼类繁殖率［7］，市场潜力巨大。ALC经ALC转移酶在人体的脑、肝脏处被合成，能够促进线粒体在脂肪酸氧化过程中对乙酰辅酶A的摄取，增加乙酰胆碱的生成，并刺激蛋白质和膜磷脂的合成。能够迅速通过血脑屏障，改善神经能量，修复神经作用机制并调节中枢神经系统中乙酰胆碱的生成，能够有效治疗和预防老年性痴呆。PLC为肉毒碱乙酰转移酶刺激剂，可剂量依赖性扩张微血管，选择性的保护内皮细胞不受组织缺氧或过氧化酶制剂引起的损伤。目前，临床上主要用于充血性心力衰竭、外周血管疾病、间歇性跛行等疾病。随着卡尼汀群的研究越来越受到重视，其临床应用亦越来越广泛。

表1 四种海螺样品的LC、ALC、PLC标准曲线方程

表2 四种海螺样品的LC、ALC、PLC含量(μmol/100 g)

本研究在前期［8，9］对血浆、尿液等样品含量测定的基础上，建立了从海螺肉中提取LC、ALC、PLC，并用荧光衍生化HPLC检测其含量，样本衍生化后色谱峰分离良好，干扰少，检测时间短，且灵敏度高、检测限低，且室温条件下即可衍生化反应，操作简便。经精密度、稳定性和回收率实验证明均能达到检测的要求，适用于食品、药品、组织以及治疗性检测需要。在方法学实验条件的探索过程中，考虑到四种海螺制备标准曲线时均需要制备空白溶液以排除内源性LC的干扰，本实验在前期研究的基础上采用透析器透析方法制备各样品卡尼汀群的空白溶液［8］。空白样品的色谱图显示，采用透析法可以有效去除内源性LC的干扰及其样本中其他未知物质的干扰，符合本实验检测海洋产品的质量要求。检测结果显示，钝拟蟹守螺中 LC、ALC、PLC含量最高，其次为疣荔枝螺、斑玉螺，海螺中含量最低。提示沿海居民常食钝拟蟹守螺可以摄取较多的LC、ALC和PLC，同时也为下一步通过提取制备卡尼汀群原料提供理论依据。

［1］赖卫华，许杨，陆豫.左旋肉碱的生理功能、应用及其制备［J］.食品工业科技，1998，(6):75-77.

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［8］Cao Y，Wang YX，Liu CJ，et al.Comparison of pharmacokinetics of L-carnitine，acetyl-L-carnitine and propionyl-L-carnitine after single oral administration of L-carnitine in healthy volunteers［J］.Clin Invest Med，2009，32(1):E13-E19.

［9］栾海云，李金莲，王少华，等.柱前衍生化HPLC法检测兔血浆和肝组织中左卡尼汀及其代谢物的含量［J］.中国临床药理学与治疗学，2010，15(6):636-640.